施越冬 郭銀鈴 徐劍煒

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科,上海 200032)

軟骨組織是人體內(nèi)重要的支撐結(jié)締組織,但軟骨缺損的自身修復(fù)能力有限,組織工程技術(shù)[1]為軟骨的修復(fù)重建提供了一個新的發(fā)展方向。纖維蛋白由于其良好的可塑性、黏附性和生物相容性而成為組織工程軟骨的主要支架材料[2]。纖維蛋白凝膠作為軟骨細(xì)胞支架材料存在生物強(qiáng)度差和降解過快的缺點(diǎn)。本研究擬探討利用碳化二亞胺(EDC)增加纖維蛋白凝膠的交聯(lián)度、生物強(qiáng)度和抗降解能力的可能性,旨在更好地構(gòu)建可注射性軟骨。

1 資料與方法

1.1 實驗相關(guān)試劑 纖維蛋白原凍干粉,凝血酶(Sigma),DMEM 培養(yǎng)液,胎牛血清(韓國吉諾),磷酸鹽緩沖液(PBS),II型膠原酶(Sigma),EDC(Pierce),0.4%臺盼藍(lán)(Sigma),LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit(Molecular Probes Inc),抗生素溶液：PBS液中含有青霉素 1000 U?mL-1,鏈霉素1000 U ?mL-1。

1.2 軟骨細(xì)胞 選自3月齡的豬耳廓軟骨。

1.3 主要實驗器材 無菌6孔培養(yǎng)板,骨蠟(強(qiáng)生),YHZ-22型恒溫振蕩器(江蘇太倉華美實驗設(shè)備廠),恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱,TDL-408B臺式離心機(jī),光學(xué)顯微鏡(Olympus),熒光顯微鏡(Olympus),超凈臺等。

1.4 實驗方法

1.4.1 EDC與纖維蛋白原反應(yīng)成膠的實驗條件

1.4.1.1 (1)凝膠樣本的制備實驗分成2大組：(1)纖維蛋白原用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成100 mg?mL-1,凝血酶 50 U?mL-1,EDC按照與纖維蛋白原不同的比例(1/10～10/10)的配比加入,按上述配好的纖維蛋白原溶液與凝血酶各1 mL加入骨蠟小格中,同時加入按上述分組稱量好的EDC,加入試劑同時用細(xì)針輕輕攪拌,觀察不同組別的凝膠化情況。(2)纖維蛋白原凍干粉用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別配制成100 mg?mL-1、200 mg?mL-1,EDC用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液配制成10 mg?mL-1、20 mg?mL-1、30 mg ?mL-1、100 mg?mL-1、200 mg ?mL-1、300 mg?mL-1的溶液。將配好的不同濃度的EDC溶液與纖維蛋白原溶液各1 mL加入骨蠟小格中。并分別置于室溫和37℃水浴中反應(yīng),觀察不同組樣本的反應(yīng)情況。對照組：纖維蛋白原200 mg?mL+凝血酶100 U?mL。

1.4.1.2 凝膠塊的水解穩(wěn)定性檢測 將第1步各組反應(yīng)所得到的凝膠塊用PBS緩沖液漂洗2遍后置于無菌6孔培養(yǎng)板,各加入等量的含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中,隔天換液,觀察樣本及培養(yǎng)液的變化情況。

1.4.1.3 凝膠塊的酶解穩(wěn)定性檢測 按前1步試驗得出的比較理想的配比,制備10 mm×10 mm×5 mm大小的凝膠塊,PBS漂洗后,置于6孔培養(yǎng)板,各加入5 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,觀察凝膠塊的消化降解情況,記錄樣本完全降解的時間。

1.4.1.4 按上步實驗檢測結(jié)果,選用較為理想的配比制備成同樣大小的凝膠塊,固定干燥后,送檢電鏡掃描,查看樣本的超微結(jié)構(gòu),并估計測量孔隙大小。

1.4.2 軟骨細(xì)胞在EDC交聯(lián)的纖維蛋白凝膠支架中的生長情況

1.4.2.1 豬耳軟骨細(xì)胞的獲取 選用3個月齡體質(zhì)量約50 kg豬耳廓軟骨,經(jīng)麻醉、消毒,切取豬耳,剝除皮膚筋膜及軟骨膜,切成直徑＜1 mm的軟骨顆粒,用0.05%Ⅱ型膠原酶消化16 h,收集細(xì)胞,臺盼藍(lán)染色檢查細(xì)胞活力、計數(shù)。

1.4.2.2 體外軟骨組織工程樣本的制備 (1)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備(200 mg纖維蛋白原+5×106細(xì)胞)?mL-1的纖維蛋白原細(xì)胞懸液。EDC分別用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成100 mg?mL-1,200 mg?mL-1,300 mg?mL-1。(2)制作骨蠟小格,規(guī)格為5 mm×10 mm×10 mm。(3)將配好的纖維蛋白原細(xì)胞懸液分別與不同濃度的EDC溶液(各取200μL)加入骨臘小格中。加入試劑同時用細(xì)針攪拌均勻,置于37℃溫箱中反應(yīng)6個h,每隔1 h攪拌1次,待標(biāo)本凝結(jié)后撤去骨蠟。

1.4.2.3 各組樣本制作好后放入6孔培養(yǎng)板,加入等量含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天換液,觀察凝膠塊的變化,倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況及纖維蛋白凝膠的降解情況。

1.4.2.4 實驗的第 1,第 4,第 7,第10天,不同組別的標(biāo)本各取1塊,用 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit對凝膠塊進(jìn)行熒光染色,染色30 min后用PBS緩沖液漂洗2次。操作過程中嚴(yán)格注意避光,防止熒光淬滅。染色完畢后,將樣本置于玻片上,于正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的活力情況,用藍(lán)光激發(fā)可見活細(xì)胞呈綠色,用綠光激發(fā)死細(xì)胞呈紅色。

2 結(jié) 果

2.1 第1組實驗發(fā)現(xiàn)EDC/纖維蛋白原＞2/10的組別不能形成凝膠 凝膠化的強(qiáng)度均較對照組差,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),1周內(nèi)均完全降解。

2.2 第2組實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在37℃反應(yīng)條件下,如表1的配比可形成比較理想的凝膠。

2.3 按表1分組配比制成10 mm×10 mm×5 mm大小的凝膠樣本,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。連續(xù)觀察1個月,各組培養(yǎng)液無渾濁,凝膠塊的大小和形態(tài)均無任何變化。

表1 4組凝膠組成配比

2.4 酶解穩(wěn)定性檢測 按表分組制成10 mm×10 mm×5 mm大小的凝膠塊,每組各加入5 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶,結(jié)果示對照組消化4 h后凝膠塊完全降解,實驗組(1)17 h完全降解,實驗組(2)和實驗組(3)消化24 h后凝膠塊仍未完全降解。

2.5 電鏡掃描結(jié)果 對照組為疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)不規(guī)則,孔隙大小約為50～150 μ m。實驗組的超微結(jié)構(gòu)較對照組明顯緊致有序,且實驗組(1)＜實驗組(2)＜實驗組(3),孔隙大小分別為50～100μm、20 ～ 50μm和 10 ～ 30μm。

2.6 組織工程軟骨樣本體外培養(yǎng)結(jié)果

2.6.1 培養(yǎng)第1天,倒置顯微鏡下觀察,見各實驗組樣本內(nèi)細(xì)胞分布均勻,形態(tài)完整?；罴?xì)胞熒光檢測見各樣本細(xì)胞生存良好,實驗組(3)見少量死細(xì)胞。

2.6.2 培養(yǎng)第4天,倒置顯微鏡下觀察,見實驗組(1)的細(xì)胞仍保持著完整的細(xì)胞形態(tài),實驗組(2)可見部分細(xì)胞呈空泡狀,實驗組(3)細(xì)胞幾乎都是空泡狀?；罴?xì)胞熒光染色檢測示對照組和實驗組(1)細(xì)胞活力良好,實驗組(2)見較多的死細(xì)胞,實驗組(3)凝膠塊中未見存活細(xì)胞。

2.6.3 培養(yǎng)第7天,對照組凝膠塊表面呈白色絮狀物,光學(xué)顯微鏡下見培養(yǎng)液中有少量游離的細(xì)胞?；罴?xì)胞熒光檢測見對照組和實驗(1)組細(xì)胞存活良好,實驗(2)組大部分細(xì)胞死亡。

圖1 纖維蛋白原200 mg?mL-1,凝血酶 100 U?mL-1,熒光顯微鏡觀察(×10),第7天

2.6.4 培養(yǎng)第10天,對照組凝膠塊體積減小了約1/4,強(qiáng)度下降明顯,培養(yǎng)板底部見較多的白色絮狀物,倒置光學(xué)顯微鏡下見培養(yǎng)液中游離細(xì)胞增多。實驗組(1)凝膠塊形態(tài)和強(qiáng)度仍無明顯變化?；罴?xì)胞熒光檢測示2組樣本內(nèi)細(xì)胞存活良好。

圖2 纖維蛋白原200 mg?mL-1,EDC100 mg?mL-1,熒光顯微鏡觀察(×10),第7天

圖3 纖維蛋白原200 mg?mL-1,EDC200 mg?mL-1,熒光顯微鏡觀察(×10),第7天

3 討 論

3.1 凝血酶通過酶解纖維蛋白原,使其α和β鏈釋放出纖維蛋白A肽和B肽,從而改變纖維蛋白原分子的電荷和構(gòu)象,形成有活性的纖維蛋白單體,纖維蛋白單體通過氫鍵及靜電引力作用聚合成纖維蛋白凝膠。EDC作為蛋白交聯(lián)劑,通過與氨基反應(yīng)形成可與氨基反應(yīng)的O-酰基脲中間體進(jìn)行快速多肽縮合反應(yīng)。凝血酶本身是多肽蛋白,當(dāng)EDC和凝血酶同時存在時,EDC同樣可作用于凝血酶,改變其分子結(jié)構(gòu),抑制其活性,EDC亦可作用于纖維蛋白原,阻礙其釋放肽鏈而不能被激活。因此在第1大組實驗中,各組反應(yīng)難以凝膠化或僅在EDC濃度較低時形成穩(wěn)定性差的凝膠。

3.2 EDC作為交聯(lián)劑廣泛應(yīng)用于化工行業(yè),近年來逐漸在組織工程學(xué)上的應(yīng)用。EDC分子呈線性結(jié)構(gòu),作為多肽縮合劑和交聯(lián)劑,可用于羧基和氨基的縮合反應(yīng)。EDC通過與氨基反應(yīng)形成O-酰基脲中間體,可進(jìn)一步與氨基反應(yīng)形成多肽聚合物,或在N-羥基丁二酰亞胺(NHS)存在時進(jìn)一步與羧基基團(tuán)反應(yīng)生成酯化物,增強(qiáng)了交聯(lián)效應(yīng)。但是NHS溶液呈酸性,細(xì)胞生長條件難以控制,不適用于構(gòu)建可注射性軟骨,因此在本研究中未用NHS。EDC交聯(lián)過程中不進(jìn)入材料基質(zhì),而是生成水溶性的脲衍生物,細(xì)胞毒性小。目前EDC主要用于三維支架材料的交聯(lián)制備,近年來在人工真皮[3]、角膜[4]、血管內(nèi)皮、軟骨等組織工程支架的實驗研究中已證明EDC作為交聯(lián)劑制備組織工程支架材料的可行性。

3.3 傳統(tǒng)的纖維蛋白凝膠作為細(xì)胞支架材料存在著生物強(qiáng)度差和降解時間過快的缺點(diǎn)。EDC通過與纖維蛋白分子上的氨基和羧基反應(yīng),使分子間相互反應(yīng)聚合,形成比傳統(tǒng)纖維蛋白凝膠更為穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果表明,EDC交聯(lián)形成的纖維蛋白凝膠比傳統(tǒng)纖維蛋白凝膠有更好的生物強(qiáng)度,置入模擬細(xì)胞生長條件的環(huán)境中仍保持較好的穩(wěn)定性。進(jìn)一步使用II型膠原酶對樣本進(jìn)行消化降解檢測不同組別的酶解穩(wěn)定性,結(jié)果表明EDC交聯(lián)形成的纖維蛋白凝膠抗酶解能力明顯提高,且隨著EDC濃度的升高而增強(qiáng)。

3.4 電鏡掃描結(jié)果顯示,EDC交聯(lián)的纖維蛋白凝膠較對照組有著更緊密有序的三維空間結(jié)構(gòu),平均孔徑逐漸縮小,交聯(lián)密度隨著EDC濃度的增加而加強(qiáng)。EDC在提高纖維蛋白凝膠穩(wěn)定性的同時又保留了支架的三維多孔空間結(jié)構(gòu)。

3.5 本研究中所用的LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit的作用原理基于目前公認(rèn)的2個衡量細(xì)胞生存活力的指標(biāo),包括細(xì)胞內(nèi)酯酶活性和細(xì)胞膜的完整性,這是目前國際上公認(rèn)的檢測細(xì)胞活力快速、有效的方法。用該試劑盒檢測凝膠塊中細(xì)胞的生存活力具有敏感、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

3.6 EDC交聯(lián)過程中不進(jìn)入凝膠基質(zhì),而是生成水溶性的脲衍生物,無細(xì)胞毒性。實驗過程中,實驗組(2)(纖維蛋白原200 mg?mL-1+EDC 200 mg?mL-1)樣本內(nèi)的細(xì)胞在培養(yǎng)1周時大部分死亡,實驗組(3)(纖維蛋白原200 mg?mL-1+EDC 300 mg?mL-1)樣本內(nèi)的細(xì)胞在培養(yǎng)第4天時全部死亡?？赡苡?種原因：(1)這2種支架材料空間結(jié)構(gòu)太緊密,不能為細(xì)胞的生長提供足夠的空間,限制了培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的流通,阻礙了細(xì)胞的生長,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。(2)由于反應(yīng)成膠的時間較長,反應(yīng)過程中高濃度的EDC有一定的細(xì)胞毒性,影響細(xì)胞活力導(dǎo)致死亡。因此該2種實驗配比不適用于構(gòu)建組織工程軟骨。

3.7 本研究結(jié)果表明,在實驗觀察期間,軟骨細(xì)胞在對照組(纖維蛋白原200 mg?mL-1+凝血酶100 U?mL-1)和實驗組(1)(纖維蛋白原200 mg?mL-1+EDC 100 mg?mL-1)的支架材料中存活良好,在第10天仍保持較好的活力。而對照組在第7天開始出現(xiàn)降解現(xiàn)象,發(fā)生細(xì)胞從凝膠塊中脫離現(xiàn)象。而實驗組(1)在培養(yǎng)的第10天凝膠塊的形態(tài)和強(qiáng)度仍無明顯變化,說明該支架材料不僅能為細(xì)胞的生存提供足夠的條件,而且有更強(qiáng)的抗降解能力,具備構(gòu)建組織工程軟骨的可能性。但是該實驗配比制備的纖維蛋白凝膠對軟骨細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌沉積有無影響,以及是否能夠在大型動物體內(nèi)成功構(gòu)建組織工程軟骨尚需要進(jìn)一步研究。

總之,適當(dāng)濃度EDC交聯(lián)的纖維蛋白凝膠在生物強(qiáng)度和抗酶解能力方面較傳統(tǒng)的纖維蛋白凝膠有明顯提高,所形成的多孔隙網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能為細(xì)胞的生長提供足夠的空間,軟骨細(xì)胞在該支架材料內(nèi)存活良好。但是過高濃度的EDC交聯(lián)形成的支架則限制了細(xì)胞的生長。

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