黃維甄 謝劍明 陳錦章 李榮 張?zhí)m英 李黎波 羅榮城

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤中心,廣東 廣州 510515)

自20世紀(jì)70年代光動(dòng)力療法進(jìn)入臨床研究以來(lái),它不僅在各種良性疾病的治療中取得了很好的療效,并且在惡性腫瘤的治療中取得了令人矚目的成就[1]。光動(dòng)力治療(photodynamic therapy,PDT)也稱光化學(xué)反應(yīng),氧、光敏劑和激光(常用激光)是其基本要素,其基本原理是利用某些光敏劑在新生物組織的定向分布或優(yōu)先分布,同時(shí)在相應(yīng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光激發(fā)下,這些光敏劑能夠激活,從而產(chǎn)生活性分子[2-3],這些活性分子包括單線態(tài)氧或三重態(tài)氧,它們和相鄰的多種生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng),進(jìn)而對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體等)造成不可逆性損傷,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前我國(guó)食管癌發(fā)病率居世界第1位,且90%的病理類型為鱗癌。由于光動(dòng)力治療具有創(chuàng)傷小、毒性小、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),已逐漸成為食管癌的一種治療手段,但在臨床治療中,其療效并不穩(wěn)定。本研究是采用我國(guó)自主研發(fā)的第3代光敏劑-喜泊分(HiPorfin),研究不同濃度光敏劑及不同光照劑量密度對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌Eca-109細(xì)胞體外效應(yīng)的影響,探討PDT殺傷人食管癌細(xì)胞效應(yīng)與孵育濃度及光照劑量密度的關(guān)系,為臨床HiPorfin-PDT的治療參數(shù)選擇提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 試劑及設(shè)備 喜泊芬每瓶5 mL 25 mg(重慶市華鼎現(xiàn)代生物制藥有限責(zé)任公司);Bio-Rad550型博賽自動(dòng)酶標(biāo)儀;DIOMED 630型半導(dǎo)體激光器;CO2培養(yǎng)箱;LXJ-Ⅱ離心沉淀機(jī);倒置相差顯微鏡;人食管癌細(xì)胞株Eca-109。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI-1640高糖培養(yǎng)基,10%小牛血清,青霉素及鏈霉素雙抗,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),3～5 d傳代1次。

1.3 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)喜泊芬-PDT對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(第3天,細(xì)胞長(zhǎng)滿約占培養(yǎng)瓶的80%)Eca-109細(xì)胞,胰蛋白酶消化30 s～1 min,鏡下觀察細(xì)胞大部分變形后棄消化液,加入RPMI-1640培養(yǎng)液,吹打,以1000 r?min-1離心5 min,取上清液,加入全培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞濃度為105?mL-1,接種于96孔板,每孔100 mL,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,加入光敏劑,每孔 100μL。Eca-109細(xì)胞分為PDT實(shí)驗(yàn)組和完全空白對(duì)照組。PDT實(shí)驗(yàn)組加入不同孵育濃度的喜泊芬(每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔),使喜泊芬終濃度為：0、2.5 、5.0、10.0、15.0 、20.0 μ g ?mL-1。加入喜泊芬后繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h,去培養(yǎng)液,PBS洗3次后加入含2%小牛血清的1640培養(yǎng)液后除空白對(duì)照組外均即刻給予光照,光源采用DIOMED 630 PDT系統(tǒng),波長(zhǎng)630 nm,給予飽和光劑量照射,光照劑量密度分別為 0、12、24、30 J?cm-2。光照后繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,每孔加入 MT T 20μL,并繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h后去培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜100μL,于振蕩器上搖勻后于酶標(biāo)儀上測(cè)A570OD值,并按照以下公式計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率=(光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)組A570OD值-本底組A570OD值)/(完全空白對(duì)照A570OD值-本底組A570OD值)[4]。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0分析軟件,采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。

2 結(jié) 果

在喜泊芬不同孵育濃度及不同光照劑量密度下PDT對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞體外效應(yīng)的影響見(jiàn)表1和圖1。

表1 不同孵育濃度喜泊芬及不同光照劑量密度食管癌Eca-109細(xì)胞的生存率(%)比較 ()

表1 不同孵育濃度喜泊芬及不同光照劑量密度食管癌Eca-109細(xì)胞的生存率(%)比較 ()

光照劑量密度(J?cm-2)喜泊芬濃度(μ g?mL-1)02.5 5.0 10.0 15.0 20.0合計(jì) F值 P值0 0.96±0.020.96±0.010.97±0.020.96±0.030.91±0.050.96±0.030.96±0.0312 0.96±0.010.86±0.030.76±0.030.60±0.040.42±0.050.40±0.040.67±0.22 157.58 ＜0.0124 0.95±0.020.74±0.020.63±0.030.52±0.060.18±0.020.15±0.020.53±0.30 325.69 ＜0.0130 0.95±0.000.72±0.010.63±0.020.50±0.040.16±0.030.11±0.030.52±0.30 521.2 ＜0.01合計(jì) 0.96±0.010.82±0.100.75±0.150.65±0.200.42±0.320.40±0.36 — 701.82 ＜0.01 F值 115.69 132.63 81.18 266.43 562.03 898.68 80.39 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 喜泊芬不同孵育濃度(J?cm-2)和不同光照劑量密度(μ g?mL-1)間的交互效應(yīng)

從表1及圖1可見(jiàn),喜泊芬的不同孵育濃度和在4種不同光照劑量密度下食管癌Eca-109細(xì)胞的生存率均有顯著差異(P＜0.01)。同一光照劑量密度下(除濃度為0 μ g?mL-1組外),不同喜泊芬孵育濃度的食管癌 Eca-109細(xì)胞的生存率有顯著差異(P＜0.000),同一喜泊芬孵育濃度下(除光照劑量密度為0 J/cm2組外),不同光照劑量密度的食管癌Eca-109細(xì)胞的生存率亦有顯著差異(P＜0.01)。光照劑量密度與孵育濃度之間有顯著的交互效應(yīng)(P ＜0.01),當(dāng)孵育濃度為20 μ g?mL-1,光照劑量密度為24 J?cm-2時(shí)其殺傷效應(yīng)最強(qiáng)。孵育濃度由 15.0 μ g?mL-1增加到 20 μ g ?mL-1時(shí),光照劑量密度由 24 J?cm-2延長(zhǎng)為 30 J?cm-2并不能提高殺傷效應(yīng),這說(shuō)明當(dāng)喜泊芬孵育濃度和光照劑量密度達(dá)到一定程度時(shí),其殺傷效應(yīng)已達(dá)到平臺(tái)期。

3 討 論

在我國(guó),食管癌的發(fā)病率和死亡率仍均居惡性腫瘤的第2位,僅次于胃癌[5]。隨著我國(guó)腫瘤治療水平的進(jìn)展,食管癌的療效有了一定的提高。光動(dòng)力治療PDT在食管癌,尤其是早期食管癌及癌前病變,如Barret食管的治療上已取得很大進(jìn)展[6]。目前PDT已成為繼放化療后治療食管癌的另一重要手段,并且在中晚期食管癌的治療中取得較好的療效[7]。居云勝等[8]報(bào)道,PDT治療食管癌的有效率高達(dá)76%,并且具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)能選擇性地消滅腫瘤細(xì)胞而不損害正常組織;(2)與化療、放療有一定協(xié)同作用;(3)可以縮小手術(shù)的范圍和改善手術(shù)的預(yù)后。PDT的作用原理是光敏劑通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞器結(jié)合在腫瘤組織中大量積存,光照后所產(chǎn)生單線態(tài)氧和大量的氧自由基對(duì)其生物膜和線粒體造成損害,從而影響線粒體呼吸鏈中許多酶,如細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、單胺氧化酶、乳酸脫氫酶、磷酸激酶以及微粒體細(xì)胞色素P450的活性,因而減少ATP的合成[9-10]。這些均可直接或間接地影響到腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究[11]揭示光敏劑在腫瘤細(xì)胞中容易積存是因?yàn)樾律?xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)大量的低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLP),而腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜上具有比靜止細(xì)胞更多的LDLP。這使得一些易附于LDLP上的親脂性光敏劑在腫瘤細(xì)胞上高度聚集。從PDT作用機(jī)制可見(jiàn),在細(xì)胞的體外PDT效應(yīng)中,光照劑量密度、光敏劑的種類和光敏劑的孵育濃度及孵育時(shí)間均可影響其效應(yīng)。本研究結(jié)果表明,喜泊芬的不同孵育濃度和4種不同光照劑量密度的食管癌Eca-109細(xì)胞生存率均有顯著差異(P＜0.01)。在同一光照劑量密度下(除濃度為0 μ g?mL-1組外),不同喜泊芬孵育濃度的食管癌Eca-109細(xì)胞的生存率有顯著差異(P＜0.01),同一濃度下(除光照劑量密度為0 J?cm-2組外),不同光照劑量密度的食管癌Eca-109細(xì)胞生存率亦有顯著差異(P＜0.01)。光照劑量密度與孵育濃度之間有顯著的交互效應(yīng)(P＜0.01),當(dāng)孵育濃度和光照劑量密度達(dá)到一定程度時(shí),其殺傷效應(yīng)達(dá)到平臺(tái)期。有研究[12]結(jié)果表明,這可能與細(xì)胞存在胞內(nèi)飽和光敏劑濃度相關(guān)。因此對(duì)于同一種光敏劑,當(dāng)孵育濃度和光照劑量密度達(dá)到一定程度時(shí),增加孵育濃度及提高光照劑量密度并不能提高PDT效應(yīng),即殺傷效應(yīng)達(dá)到了平臺(tái)期。本研究中當(dāng)光敏劑孵育濃度為15.0 μ g?mL-1而且光照劑量密度為24 J?cm-2時(shí)達(dá)到最佳治療效應(yīng),即使再提升光敏劑濃度和光照劑量密度也無(wú)法提高治療效應(yīng)。從臨床治療角度上,一旦達(dá)到最佳光照劑量密度之后,如再進(jìn)一步增加光照劑量密度,有可能導(dǎo)致正常組織的損傷,因此不提倡過(guò)多的光照劑量。綜上所述,在特定孵育時(shí)間下,光敏劑孵育濃度及光照劑量密度為影響PDT效應(yīng)的主要因素,本研究為臨床HiPorfin-PDT參數(shù)的選擇提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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