丁小軍 龔逸明 張萍 沈毅 郭雪華 余優(yōu)成 顧章愉

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔科,上海 200032;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院,口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科,上海 200011;3.上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所,上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室,上海 200011)

富士(GC)護牙素是近年來研制出的主要用于釉質(zhì)再礦化治療的產(chǎn)品,在口腔正畸臨床被常規(guī)用于預(yù)防托槽周圍牙齒表面的脫礦,預(yù)防齲齒的發(fā)生。其主要成分是酪蛋白磷酸多肽-無定形磷酸鈣(casein phosphopeptide-amorphouscalcium phosphate,CPP-ACP)。CPP-ACP主要是通過釋放大量的活性鈣離子來促進釉質(zhì)的再礦化[1]。但現(xiàn)有的研究[2]結(jié)果表明,生理狀況下,細(xì)胞外鈣濃度的增加是誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞脫離細(xì)胞周期進行終末分化的主要原因。在口腔矯治過程中由于矯治器的刺激,口腔潰瘍的發(fā)生率大為增高,如果潰瘍發(fā)生的同時應(yīng)用GC護牙素,是否會通過鈣的釋放增加細(xì)胞外鈣濃度影響以上皮增殖為主的口腔潰瘍的愈合過程,尚無學(xué)者對此作相關(guān)研究。本研究通過GC護牙素對口腔黏膜來源的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系NB和NT細(xì)胞[3]增殖的影響來對此問題進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器 BP-800酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀,GC護牙素(GC公司,日本),FACS Calibur流式細(xì)胞儀,PI/RNase Staining Buffer,Annexin V：FITC Apoptosis Detection Kit I,RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液,胎牛血清。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系NB和NT由中國口腔組織培養(yǎng)和收集中心提供。選用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后,用0.25%胰酶消化成單個細(xì)胞,傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.3 四甲基偶氮唑鹽比色(MT T)法檢測GC護牙素對NB和NT細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期NB和NT細(xì)胞,胰蛋白酶消化,接種細(xì)胞于96孔板中,接種密度為1×104?mL-1,每孔接種0.2 mL。24 h后,分別換用GC護牙素濃度為0(對照組)和10-3(實驗組0.05 g GC護牙素溶解于100 mL培養(yǎng)液中)的含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換培養(yǎng)液1次,每天采用MTT比色法于490 nm處測定細(xì)胞吸光值,連續(xù)測定8 d。每組每天設(shè)5個復(fù)孔。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測GC護牙素對NB和NT細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 取對數(shù)生長期NB和NT細(xì)胞,胰蛋白酶消化,接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中,接種密度為1×105?mL-1。24 h后,分別換用GC護牙素濃度為0和10-3的含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。處理24 h后,分別消化、收集各組細(xì)胞,每個樣本至少有1×106個細(xì)胞。PBS洗2次,1 mL 70%的PBS冰乙醇固定,4℃過夜后,PBS洗 2次,加入 0.5 mL PI/RNase Staining Buffer,常溫避光孵育15 min。上機測定各組細(xì)胞 DNA含量。重復(fù)實驗3次,取平均值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測GC護牙素對NB和NT細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞培養(yǎng)及處理同細(xì)胞周期檢測。消化后的細(xì)胞用PBS洗2次,Binding Buffer重懸細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移到流式管內(nèi)(每管內(nèi)液體總體積為100μL)。加入 Annexin V-FITC 5μL,避光常溫孵育30 min后加入PI 5μL,避光常溫孵育5 min。加入400μL Binding Buffer補足體積。上機檢測細(xì)胞凋亡情況。重復(fù)實驗3次,取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件包進行統(tǒng)計分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GC護牙素對NB和NT細(xì)胞增殖的影響 從細(xì)胞生長曲線可以看出,與對照組相比,10-3濃度的GC護牙素對NB和NT細(xì)胞的生長有輕度抑制作用(圖1和圖2)。

圖1 GC護牙素對NB細(xì)胞生長的影響

圖2 GC護牙素對NT細(xì)胞生長的影響

2.2 GC護牙素對NB和NT細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 與對照組相比,GC護牙素處理24 h后,NB和NT細(xì)胞的G0G1期和S期百分比有顯著差異。實驗組G0G1期細(xì)胞百分比明顯高于對照組,而S期細(xì)胞百分比則略有減少,見表1。

2.3 GC護牙素對NB和NT細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比,10-3濃度的GC護牙素處理24 h后,NB和NT細(xì)胞的凋亡率無顯著差異,見表2。

表1 GC護牙素對NB和NT細(xì)胞細(xì)胞周期的影響(,%)

注：與對照組比較,*P＜0.05

表2 GC護牙素對NB和NT細(xì)胞凋亡的影響(,%)

表2 GC護牙素對NB和NT細(xì)胞凋亡的影響(,%)

組別(GC護牙素濃度)n NB細(xì)胞 NT細(xì)胞對照組 3 6.24±2.38 6.86±1.97實驗組 3 7.95±1.92 9.10±2.61

3 討 論

CPP-ACP同時具有抑制牙釉質(zhì)脫礦和促進牙釉質(zhì)再礦化的作用。CPP黏附在牙面和菌斑上,抑制菌斑中變鏈菌的繁殖,減少酸的產(chǎn)生,同時與鈣離子和磷酸鹽離子作用并使之穩(wěn)定地保持在水溶非結(jié)晶狀態(tài);處于水溶狀態(tài)下ACP中的活性鈣離子和磷酸鹽離子可以滲入牙面,補充牙釉質(zhì)下齲損區(qū)的礦物質(zhì),生成羥基磷灰石或氟化羥基磷灰石,這樣不但限制了脫礦區(qū)的擴展,同時也修復(fù)了已受損的牙體結(jié)構(gòu),有效地防止了牙面上的白斑形成和促使已生成的白斑消失[4-6]。近年來,為更好的發(fā)揮 CPPACP的防齲效果,CPP-ACP已經(jīng)被加入一些產(chǎn)品中。這些產(chǎn)品包括市場上可購買到的無糖口香糖、薄荷糖、凝膠以及實驗測試用的玻璃離子水門汀和運動飲料等[7]。GC護牙素目前已被廣泛用于正畸后白斑的預(yù)防和美白、潔治后的脫敏以及常規(guī)的口腔保健等。

Cehreli等[8]曾經(jīng)用不同稀釋濃度(10-3、10-4、10-6、10-8和 10-12)的 GC護牙素處理 L929細(xì)胞(小鼠肺成纖維細(xì)胞),以探討GC護牙素作為外傷離體牙轉(zhuǎn)運介質(zhì)的可能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除了10-3和10-4濃度處理外,其他濃度處理的細(xì)胞均有不同程度的增殖;經(jīng)10-3和10-4濃度的GC護牙素處理的細(xì)胞迅速凋亡,經(jīng)10-6和10-8濃度的GC護牙素處理的細(xì)胞凋亡相對較少,而經(jīng)10-12濃度的GC護牙素處理的細(xì)胞則沒有發(fā)生凋亡反應(yīng)。本研究結(jié)果表明,高濃度的GC護牙素對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖確實具有一定的抑制作用。進一步的細(xì)胞周期分析和凋亡檢測的結(jié)果顯示,經(jīng)10-3濃度的GC護牙素處理24 h后,無論是NB還是NT細(xì)胞,G0G1期細(xì)胞的百分比都有少量的增加,S期細(xì)胞的百分比則明顯下降。但GC護牙素對細(xì)胞的凋亡并無明顯的影響,說明GC護牙素對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長抑制作用并非是通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

口腔潰瘍特別是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是一種常見病、多發(fā)病[9-11]。而在口腔矯治過程中,由于矯治器的刺激,口腔潰瘍的發(fā)生率大為上升。上皮細(xì)胞的增殖是口腔潰瘍愈合機制中的一個重要組成部分。在矯治器刺激導(dǎo)致的潰瘍愈合過程中,如果在局部應(yīng)用GC護牙素防齲,CPP-ACP中釋放的活性鈣可能會使細(xì)胞外的鈣濃度持續(xù)提高。而根據(jù)Bikle等[2]的研究,細(xì)胞外鈣濃度的升高,會通過激活一系列的通路,最終使上皮中的角化形成細(xì)胞脫離細(xì)胞周期,停止增殖,表達(dá)分化指標(biāo)而發(fā)生終末分化。我們研究[12]的另一項結(jié)果也證實,細(xì)胞外鈣濃度的增加確實可以促使口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的分化。這樣,應(yīng)用GC護牙素就可能通過升高口腔上皮細(xì)胞外的鈣濃度來影響潰瘍的愈合過程。盡管本研究的結(jié)果提示10-3濃度的GC護牙素有輕度抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的作用,由于臨床使用GC護牙素是以原產(chǎn)品1日1次或數(shù)次直接涂于牙面,初始作用濃度很高,之后由于唾液的稀釋濃度逐漸降低。本研究中,因為GC護牙素10-3濃度是我們所能制備的最高濃度,與實際應(yīng)用的情況并非完全一致,口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞也不是真正的口腔潰瘍處的口腔黏膜基底細(xì)胞,所以,本研究只是對此作了初步的探討,最終的結(jié)論仍有待進一步的動物實驗或臨床實驗證實。

1 Reynolds EC.Anticariogenic complexes of amorphous calcium phosphate stabilized by casein phosphopeptides：a review[J].Spec Care Dentist,1998,18(1)：8-16.

2 Bikle DD,Ng D,Tu CL,et al.Calcium-and vitamin D-regulated keratinocy te differentiation[J].Mol Cell Endocrinol,2001,177(1-2)：161-171.

3 Zhang P,Zhang Y,Mao L,et al.Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumo r stem cell phenotypes[J].Cancer Lett,2009,277(2)：227-234.

4 Yamaguchi K,Miyazaki M,T akamizawa T,et al.Effect of CPP-ACP paste on mechanical properties of bovine enamel as determined by an ultrasonic device[J].J Dent,2006,34(3)：230-236.

5 Rose RK.Effects of an anticariogenic casein phosphopeptide on calcium diffusion in streptococcal model dental plaques[J].A rch O ral Biol,2000,45(7)：569-575.

6 Iijima Y,Cai F,Shen P,et al.Acid resistance of enamel subsurface lesions remineralized by a sugar-free chewing gum containing casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate[J].Caries Res,2004,38(6)：551-556.

7 Cross KJ,Huq NL,Reynolds EC.Casein phosphopeptides in oral health--chemistry and clinical applications[J].Curr Pharm Des,2007,13(8)：793-800.

8 Cehreli SB,Gurpinar AO,Onur AM,et al.In vitro evaluation of casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate as a potential tooth transport medium：viability and apoptosis in L929 fibroblasts[J].Dent T raumatol,2008,24(3)：314-319.

9 劉宗響,周正國.腫痛安聯(lián)合地塞米松治療復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的療效評價[J].上?？谇会t(yī)學(xué),2006,15(5)：555-556.

10 Munoz-Corcuera M,Esparza-Gómez G,González-Moles M A,et al.Oral ulcers：clinical aspects.A tool for dermatologists.Part II.Chronic ulcers[J].Clin Exp Dermatol,2009,34(4)：456-461.

11 Munoz-Corcuera M,Esparza-Gómez G,González-Moles M A,et al.Oral ulcers：clinical aspects.A tool for dermatologists.Part I.Acute ulcers[J].Clin Exp Dermatol,2009,34(3)：289-294.

12 丁小軍,孫堅,王麗珍,等.舌鱗癌SENP5的表達(dá)及其臨床意義[J].中國口腔頜面外科雜志,2009,7(4)：342-346.