杜施霖 張亞平 姚晨玲 薛淵 欒驍 樊帆 童朝陽

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院,上海 200032)

龍芽楤木(Aralia Elata Miq Seem)是五加科藥用植物,又名遼東楤木、刺龍芽、刺老芽,其提取物的主要成分為皂苷(Aralosides,As)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[1-2]表明,龍芽楤木皂苷具有抗炎及抗氧化作用。我們既往的研究[3]發(fā)現(xiàn),As能夠有效地對抗慢性乙醇攝入造成的過氧化損傷、防治乙醇性肝病。本研究通過觀察As對乙醇誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)以及病理變化的影響,評價(jià)其對小鼠急性乙醇性肝損傷的預(yù)防作用。

1 資料與方法

1.1 藥品、動物及試劑 As由龍芽楤木根莖提取總皂甙。SPF級雄性昆明小鼠,平均體質(zhì)量(20±2)g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。56度白酒由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠生產(chǎn)。GSH-Px、SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 急性乙醇中毒模型的制備和動物分組 50只小鼠隨機(jī)分為5組：對照組(N 組)、模型組(M 組)、低劑量干預(yù)組(L組)及高劑量干預(yù)組(H組),每組10只。模型組以56度白酒按14 mL?kg-1體質(zhì)量灌胃,每日1次,連續(xù)10 d。干預(yù)組于乙醇灌胃前30 min分別腹腔注射不同劑量As。對照組僅用等劑量的0.9%氯化鈉液代替乙醇灌胃腹腔注射。各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間均正常進(jìn)食普通飼料,每日稱體質(zhì)量以調(diào)整給藥劑量。

1.3 標(biāo)本的留取 各組小鼠末次給藥后16 h,摘眼球取血,離心取血清,-20℃保存。取小鼠肝臟,0.9%氯化鈉液沖洗,濾紙吸干,稱體質(zhì)量,然后分成2份,1份以甲醛溶液固定;另一份置于-70℃冰箱保存。

1.4 肝臟指數(shù)測定 按照公式：臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.5 生化指標(biāo)測定 采用由Olympus AU 2700全自動生化分析儀測定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及天氡氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。采用硫代巴比妥酸比色法測定肝臟MDA含量;采用亞硝酸鹽法測定肝臟SOD活性;采用二硫代對硝基苯甲酸顯色法測定肝臟GSH-Px活性。操作按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.6 病理組織學(xué)檢查 將甲醛固定的肝臟標(biāo)本常規(guī)脫水、石碏包埋、切片、HE染色,光鏡下觀察病理變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組間比較用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)期間模型組小鼠精神萎靡,體重增長緩慢,毛發(fā)光澤度差。As干預(yù)組小鼠醒酒后行動敏捷,毛發(fā)光澤度較好,體質(zhì)量增長較快。

2.2 血清ALT、AST活性及肝臟指數(shù) 見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平及肝臟指數(shù)變化(,n=10)

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平及肝臟指數(shù)變化(,n=10)

注：與對照組相比,#P＜0.05;與模型組相比,△P＜0.05;與低劑量組相比,*P＜0.01

2.3 肝組織SOD、GSH-Px及MDA活性 見表2。

表2 各組小鼠肝組織SOD、GSH-Px及MDA含量變化(,n=10)

表2 各組小鼠肝組織SOD、GSH-Px及MDA含量變化(,n=10)

注：與對照組相比,#P＜0.05;與模型組相比,△P＜0.05;與低劑量組相比,*P＜0.05

2.4 肝臟病理組織學(xué)變化 對照組小鼠肝臟被膜光滑,呈紅褐色,邊緣銳利,質(zhì)地柔軟。模型組小鼠肝臟彌漫性腫大,邊緣稍鈍,有油膩感,色澤較黯淡,質(zhì)地稍硬。As干預(yù)組小鼠肝臟和對照組比較無明顯差別。HE染色顯示,對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索排列整齊,呈放射狀,胞質(zhì)分布均勻。模型組小鼠肝小葉界限不清,肝細(xì)胞索排列紊亂,胞質(zhì)出現(xiàn)大小不等空泡,部分呈氣球樣變,可見炎癥細(xì)胞浸潤。As干預(yù)組肝小葉周邊部少數(shù)肝細(xì)胞輕度水腫及輕微脂肪變性,炎癥細(xì)胞浸潤不明顯,肝脂肪變性和炎癥程度輕于模型組,不同劑量組間無明顯差異。

3 討 論

血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高是肝細(xì)胞受損的敏感指標(biāo)。機(jī)體攝入大量乙醇,可導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性增加,細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶釋放入血,使血中轉(zhuǎn)氨酶活性升高。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,急性乙醇性肝損傷小鼠血清AST及ALT活性明顯升高。給予As后,血清AST及 ALT活性均明顯降低,而且ALT及AST的降低程度與劑量成正相關(guān),說明As可以通過穩(wěn)定肝細(xì)胞膜來減輕肝細(xì)胞損傷。

乙醇在肝臟代謝過程中產(chǎn)生大量自由基,可導(dǎo)致肝細(xì)胞的變性、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,與蛋白質(zhì)或脂類聚合、交聯(lián)形成無活性的脂褐素堆積在溶酶體中,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),引起細(xì)胞的衰老和死亡,因此MDA既能反映機(jī)體內(nèi)氧化反應(yīng)水平,也能作為機(jī)體損傷的損害因子。本研究的結(jié)果顯示,與正常組相比,急性乙醇性肝損傷小鼠MDA含量明顯升高;給予As后,肝組織中MDA含量明顯減少,說明As可降低急性乙醇性肝損傷小鼠的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量,但是As不同劑量組之間無顯著差異。

體內(nèi)存在多種對抗活性氧(ROS)的保護(hù)系統(tǒng),在細(xì)胞的損傷和凋亡過程中起著重要作用[4-5]。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶之一,乙醇的攝入使其活性減弱,引起不飽和脂肪酸氧化,使DNA、蛋白質(zhì)和酶等的結(jié)構(gòu)改變,從而加速肝臟損傷。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,急性乙醇性肝損傷小鼠SOD、GSH-Px活性明顯降低;給予 As后,肝臟組織中SOD、GSH-Px活性均明顯增強(qiáng),而且其活性程度與劑量成正相關(guān),說明As可以清除自由基及降低氧化應(yīng)激水平。

綜上所述,As通過減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量及提高肝組織中SOD、GSH-Px活性,使活性氧的生成和清除重新獲得平衡,進(jìn)而改善肝功能,減輕肝細(xì)胞的脂肪堆積,可以有效防治乙醇對肝臟的損傷。

1 周重楚,孫曉波,劉威.龍芽蔥木總甙的抗炎作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1991,5(1)：30-33.

2 周重楚,師海波,李文亭.龍芽蔥木總甙的抗缺氧作用[J].中草藥,1991,22(3)：114-116.

3 杜施霖,遲寶榮.龍芽蔥木皂苷對大鼠酒精性肝病的防治作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,31(1)：64-67.

4 Wu D,Cederbaum AI.Oxidative stress and alcoholic liver disease[J].Semin Liver Dis,2009,29(2)：141-154.

5 Cederbaum AI,Lu Y,Wu D.Role of oxidative stress in alcohol-induced liver injury[J].Arch T oxicol,2009,83(6)：519-548.