劉新法 陳明軍 謝國柱 陳吉祥

(1.江蘇省泰州市人民醫(yī)院,江蘇 泰州 225300;2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

人類惡性腫瘤都是多基因病變,其發(fā)生和發(fā)展不僅與細(xì)胞異常增殖的腫瘤基因(ocogene)變異及高表達(dá)有關(guān),也直接和細(xì)胞中的抑制細(xì)胞突變和異常增殖的抑癌基因(tumor suppressor gene,TSG)功能失活相關(guān)。Dammnn等[1]利用酵母雙雜交篩選的方法從染色體3P21.3內(nèi)120 kb長最小純合缺失區(qū)分離出一種能與DNA修復(fù)蛋白XPA相互作用的基因,由于其核苷酸序列的碳端(C-terminus)與小鼠RAS相關(guān)區(qū)域家族1(RAS association domain family 1)及小鼠RAS效應(yīng)蛋白Nore1高度同源,遂命名為RAS相關(guān)區(qū)域家族1,即RASSF1基因。由于選擇性剪切和不同啟動子的使用,RASSF1基因至少存在7個不同的轉(zhuǎn)錄本(轉(zhuǎn)錄本A～G)。研究[2]發(fā)現(xiàn),RASSF1基因能直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控,在體內(nèi)和體外能抑制細(xì)胞生長,并參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法,檢測RASSF1家族中2個最主要的轉(zhuǎn)錄本在胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況,以及論證兩者之間有無相關(guān)協(xié)調(diào)表達(dá),為基因治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 胃癌組織標(biāo)本取自2009年1月—2010年2月在我院胃腸外科手術(shù)的胃癌患者,共40例,均經(jīng)病理確診,所有患者術(shù)前未經(jīng)放、化療。所有標(biāo)本均在-70℃冰箱保存待用

1.2 cDNA的制備 以 Trizol方法提取細(xì)胞總RNA并純化,用MMLV反轉(zhuǎn)錄得到5種腫瘤細(xì)胞的cDNA。

1.3 RT-PCR 利用DNAstar軟件設(shè)計(jì)RASSF1家族2種轉(zhuǎn)錄本的特異引物,以人β-actin為內(nèi)參,通過RT-PCR方法檢測這2種轉(zhuǎn)錄本在胃癌組織與癌旁組織的表達(dá)情況。引物序列如下：RASSF1A擴(kuò)增引物為：5'ATTGCAAGT TCACCTGCCAC3'(上游引物),5'CTTCCTACGTATCCTGCAGCGG3'(下游引物);RASSF1B擴(kuò)增引物為：5'AGCT TGAACAAGGACCTGT T3'(上游引物),5'CT TCCTACGTATCCTGCAGCGG3'(下游引物);以人β-actin為內(nèi)參,引物序列為：5'GAGACCT TCAACACCCCAGCC 3'(上游引物)5'GGCGTACAGGTCTT TGCGGATG 3'(下游引物),反應(yīng)條件：95℃2 min,94℃15 s,58℃30 s,72℃1.5 min,30個循環(huán),72℃10 min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)分析均應(yīng)用于SPSS 9.0軟件。組間比較采用卡方檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA的提取結(jié)果 提取胃癌組織與癌旁組織的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示,18S和28S條帶較為明顯,RNA的完整性和質(zhì)量較好(圖1)。采用核酸檢測儀(Gene SpecⅢ)檢測,A260/A280值均在1.9～2.0,其結(jié)果與電泳的結(jié)果一致,各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到反轉(zhuǎn)錄要求。

圖1 瓊脂糖電泳檢測總RNA

2.2 2種轉(zhuǎn)錄本在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá)狀況 應(yīng)用RT-PCR方法檢測上述2種轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)狀況(圖2);RASSF1A基因在40例胃癌組織中表達(dá)缺失率為60.2%(24/40),在對應(yīng)的癌旁組織中表達(dá)缺失率為22.3%(9/40),RASSF1B基因在40例胃癌組織中表達(dá)缺失率為37.5%(15/40),在對應(yīng)的癌旁組織中表達(dá)缺失率為10%(4/40)。

2.3 2種轉(zhuǎn)錄本相關(guān)性分析 RASSF1A和RASSF1B在胃癌組織中的表達(dá)無顯著相關(guān)(P＞0.05)。RASSF1A基因在胃癌組織中表達(dá)明顯缺失,癌旁組織中表達(dá)量顯著高于胃癌組織(t=4.623,4.022,P＜0.05),兩者有顯著差異,RASSF1B基因在胃癌組織及癌旁組織中均有表達(dá),但無顯著差異。

圖2 RASSF1基因2種轉(zhuǎn)錄本在胃癌及癌旁組織中的PCR擴(kuò)增

3 討 論

有研究[3]表明,在一些基因家族中,各轉(zhuǎn)錄本之間存在協(xié)調(diào)表達(dá),一旦表達(dá)平衡被打破,就會導(dǎo)致細(xì)胞不正常的增殖。因此,在不同的腫瘤組織中分析各轉(zhuǎn)錄本表達(dá)比例的變化可以分析各轉(zhuǎn)錄本與腫瘤發(fā)生間的關(guān)系。本研究結(jié)果表明,2個轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)有較大差異,尤其是RASSF1A基因在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)有顯著差異(P＜0.05)。盡管RASSF1B基因在胃癌及癌旁中表達(dá)不同,但是無顯著差異,并且兩個轉(zhuǎn)錄本基因在胃癌中的表達(dá)情況也無相關(guān)差異(P＞0.05)。

RASSF1A基因位于人類染色體3p21.3[4],是RASSF1基因家族A、B、C中的一員。其cDNA序列中含有 6 個外顯子(1α、2α β、3、4 、5 和 6)共1873 bp核苷酸,編碼由340個氨基酸組成的蛋白多肽,其相對分子量為38800,N端與富含半胱氨酸的甘油二脂或佛波酯結(jié)合區(qū)高度同源,也被稱作蛋白激酶C保守區(qū),它的生物學(xué)功能目前還未完全了解。RASSFlB基因與 RASSF1A基因主要的差別在于中部存在少數(shù)氨基酸的不同剪接方式,在正常組織和腫瘤組織中均有表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因在胃癌組織中的表達(dá)缺失率極高,將RASSF1A基因轉(zhuǎn)染入不表達(dá)該基因的癌細(xì)胞株后,可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成和非貼壁腫瘤細(xì)胞的生長,接種裸鼠后其成瘤生長能力也明顯下降,由此可以進(jìn)一步認(rèn)為RASSF1A基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要的抑制作用?？沙醪酵茢郣ASSF1A基因可以作為腫瘤組織,尤其是胃癌的腫瘤血清標(biāo)志物。關(guān)于這2個主要轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)失衡機(jī)制與兩者之間的關(guān)系目前尚不明了,還需通過更大樣本量的腫瘤組織及不同的腫瘤細(xì)胞系作進(jìn)一步研究。

1 Williams MD,Chakravarti N,Kies MS,et al.Implications of methylation patterns of cancer genes in salivary g land tumors[J].Clin Cancer Res,2006,12(24)：7353-7358.

2 Dammann R,Li C,Yoon JH,et al.Epigenetic inactivation of a ras association domain family protein from the lung tumor suppressor locus 3p21.3[J].Nat Genet,2000,25(3)：315-319.

3 Chen H,Suzuki M,NakamuraY,et al,Aberrant methylation of RASGF R2 and RASSF1A in human non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep,2006,15：1281-1285.

4 Baksh S,T ommasi S,Fenton S,et al.The tumor suppressor RASSF1A and MAP-1 link death receptor signaling to Bax conformational change and cell death[J].Molec Cell,2005,18：637-650.