劉青，劉珍伶，周娟

（1.華僑大學化工學院，福建 泉州 362021；2.蘭州大學功能有機分子化學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

金線蓮多糖的體外抗氧化活性

劉青1，劉珍伶2，周娟1

（1.華僑大學化工學院，福建 泉州 362021；2.蘭州大學功能有機分子化學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

采用體外分析的方法觀察金線蓮多糖（AFP）的抗氧化能力，研究AFP對氧自由基的清除作用及抑制脂質(zhì)過氧化的作用.結(jié)果表明，AFP能以劑量依賴的方式抑制·OH和O2-的活性，AFP在小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化中也顯示出明顯的抗氧化作用.即AFP在體外實驗中有清除自由基及抗氧化作用.

金線蓮多糖；氧自由基；脂質(zhì)過氧化；抗氧化

1 材料與方法

1.1 材料

金線蓮多糖（AFP）：金線蓮（Anoectochilus formosams）原植物由福建中醫(yī)學中藥鑒定室楊成梓教授鑒定，金線蓮多糖由蘭州大學功能有機分子化學國家重點實驗室提取、鑒定并提供.

硫代巴比妥酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20080925）；肝素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：0812111）；抗壞血酸（福建福州海王福藥制藥有限公司，批號：0901042）；硫酸亞鐵、過氧化氫、三氯乙酸等（市售分析純試劑）.

實驗動物為昆明種清潔級小鼠10只，質(zhì)量為18～22g，雌雄各半，由福州海王福藥制藥有限公司提供（許可證號：SCXK（閩）2005-0003）.

752N型紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；TDL-60B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；BS124S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，XH-C型旋渦混合器（江蘇常州國立試驗設備研究所）.

1.2 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 金線蓮多糖對·OH的清除作用［1］

·OH是活性氧中活性最高且造成損傷最大的一種，它可以與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，造成細胞壞死或突變.羥自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標.

改進Smirnoff等提出方法［1］，用FeSO4+H2O2產(chǎn)生·OH，以·OH氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示·OH的多少，即吸光值越大，·OH越多.在4mL的反應體系中，含有1mL的9mmol·L-1FeSO4，1mL的8.8mmol·L-1H2O2，1mL的9mmol·L-1水楊酸（用50％乙醇作溶劑），以及1mL不同濃度的金線蓮多糖.

加入H2O2啟動反應，于37℃下溫浴1h，測定510nm處的吸光值（A），結(jié)果如表1所示.表1中：ρ為劑量；η為清除率，即η=［A0-（Ai-Ai，o）］·×100％.其中：A0為對照物（不加金線蓮多糖）的吸光值，Ai為某濃度時的吸光值，Ai，o為無水楊酸時該濃度的本底值.從表1可知，金線蓮多糖對·OH有清除作用，且其清除率隨著金線蓮多糖的劑量的增加而增大，呈一定的量效關系.

表1 金線蓮多糖對·OH的清除作用Tab.1 Scavenging effect of AFP on·OH

在每支試管加入4.5mL的Tris-HCl緩沖液（pH=8.2），于25℃下預熱20min，加入1mL不同濃度的金線蓮多糖，再加入0.4mL的10mmol·L-1鄰苯三酚，立即搖勻；準確反應4min后，立即加入0.1mL的8mol·L-1HCl終止反應，測定325nm處的吸光值（A），結(jié)果如表2所示.表2中：清除率η=（A0-Ai）·（A0-Ai，o）-1×100％，A0為對照物（不加金線蓮多糖）的吸光值，Ai為某濃度時的吸光值，Ai，o為無鄰苯三酚時該濃度的本底值.

表2 金線蓮多糖對的清除作用Tab.2 Scavenging effect of AFP on

表2 金線蓮多糖對的清除作用Tab.2 Scavenging effect of AFP on

①與對照組比較，＊代表P＜0.05；＊＊代表P＜0.01

組別 ρ/mg·mL-1 A① η/％對照組 - 0.717±0.032 -金線蓮多糖2.5 5.0 10.0 15.0 0000 ....6532 1125 7079 ±±±± 0000 ....0000 2423 1062＊＊＊＊＊＊＊13.99 28.87 54.44 63.92

從表2可知，金線蓮多糖對O2·的清除作用與金線蓮多糖的劑量呈一定的量效關系.當金線蓮多糖的濃度為5.0mg·mL-1時，可以顯著抑制的產(chǎn)生.

2.3 金線蓮多糖對小鼠肝組織勻漿自氧化反應的影響［3］

丙二醛（MDA）為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其生成的多少可以反映出組織細胞的受損程度.首先，將小鼠頸椎脫臼致死，迅速分離出肝組織，用冷的生理鹽水洗凈后稱量；然后，于冰浴下勻漿，制成含蛋白質(zhì)為0.5％的肝勻漿懸浮液.

取5％肝勻漿懸浮液0.2mL，加入1mL不同濃度的金線蓮多糖溶液，在37℃下溫浴1h后，加入1mL，20％的TCA以終止反應；然后，再加入1mL，0.67％的TBA，于沸水浴中顯色15min.冷卻后，于4 000r·min-1的離心機中離心10min，測定532nm處的上清液吸光度.金線蓮多糖對小鼠肝勻漿中MDA生成的影響，如表3所示.表3中：清除率η=（A0-Ai）·×100％，A0為對照物（不加金線蓮多糖）的吸光值，Ai為某濃度時的吸光值.以吸光度表示MDA含量的多少.

表3 金線蓮多糖對小鼠肝自氧化的影響Tab.3 Effects of AFP on lipid peroxidation of extract from rat liver

從表3可知，金線蓮多糖可以有效抑制小鼠肝臟組織勻漿脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，且MDA的抑制率隨著金線蓮多糖濃度的增加而提高.

2.4 金線蓮多糖對Fe2+-H2O2誘導的小鼠肝線粒體中MDA生成的影響［4］

將肝組織在冰浴下以生理鹽水制成10％的勻漿，于2 000r·min-1的離心機中離心20min，取上層液；然后，以10 000r·min-1離心20min，用生理鹽水洗滌沉淀2次后，再以生理鹽水配成吸光值在0.5～0.6的線粒體懸浮液.

取2.5mL肝線粒體懸浮液，加入0.4mL不同濃度的金線蓮多糖溶液，再加入0.1mL，1mmol·L-1FeSO4和0.1mL，1mmol·L-1H2O2，在37℃下溫浴1h；然后，取0.1mL溫育后的各管溶液，加入1mL，20％的TCA以終止反應，再加入1mL，0.67％的TBA，于沸水浴中顯色15min，冷卻后離心，測定532nm處的上清液吸光值，如表4所示.

從表4可知，5個不同濃度的金線蓮多糖對Fe2+-H2O2誘導的小鼠肝線粒體中MDA生成均有顯著的抑制作用，其抑制率隨著金線蓮多糖劑量的增加而增加.

表4 金線蓮多糖對小鼠肝線粒體中MDA生成的影響Tab.4 Effects of AFP on MDA of extractfrom rat liver mitochondria

3 結(jié)束語

金線蓮是我國傳統(tǒng)中藥材，具有清熱涼血、祛風利濕等多種功效［5］.林麗清等［6］報道了金線蓮多糖能清除及·OH.文中實驗顯示，金線蓮多糖還可有效抑制小鼠肝組織及肝線粒體中MDA的生成，其作用具有一定的量效關系.由于金線蓮基本無毒，有藥食同源的歷史，金線蓮及制劑的開發(fā)一直引人注目，而其富含的多糖是一種天然抗氧化劑，進一步增加了金線蓮開發(fā)前景.

［1］SMIMFF N，CUMBES Q.Gydroyl radica scavegin activity of compaible solues［J］.Hytochemitry，1989，28（4）：1057-1060.

［2］劉青，薛秀玲，葉靜，等.納米二氧化鈦對小鼠肺、腦和肝臟組織的影響［J］.華僑大學學報：自然科學版，2009，30（2）：179-182.

［3］田京偉，楊建.白藜醇苷體外抗氧化活性［J］.中草藥，2001，32（10）：978-980.

［4］曹煒，尉亞輝，楊建雄.蜂膠對氧自由基和四氧嘧啶致小鼠肝臟損傷的保護作用［J］.中藥，2001，32（11）：1013-1015.

［5］劉賢旺，黃慧蓮，袁勇.金線蓮多糖的研究進展［J］.江西中醫(yī)學院學報，1999，11（4）：188-189.

［6］林麗清，黃麗英，鄭艷潔等.金線蓮多糖的提取及清除氧自由基作用的研究［J］.福建中醫(yī)學院學報，2006，16（5）：37-39.

Study on Antioxidative Activity ofAnoectochilus f ormosams Polysaccharide in Vitro

LIU Qing1，LIU Zhen-ling2，ZHOU Juan1
（1.College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering，State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

The antioxidant capacities ofA noectochilus formosamspolysaccharide（AFP）were investigated by in vitro assay.The scavenging effects of AFP on oxygen radicals and its inhibitory effect on lipid peroxidation were studied.Results showed that AFP exhibited inhibitory effects on the hydroxyl free radical（·OH）and superoxide anion free radical（O2-） in a dose-dependent manner.It also showed substantial antioxidant activities in the mice liver tissue homogenate.So AFP had scavenging radicals effect and antioxidant activities in the in vitro experiments.

Anoectochilus formosamspolysaccharide；oxygen radical；lipid peroxide；antioxidation

R 282.71

A

1000-5013（2010）06-0718-03

（責任編輯：黃仲一 英文審校：陳國華）

2010-04-03

劉青（1970-），女，副教授，主要從事藥理學的研究.E-mail：liuq@hqu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目（20972061）