石 娜 ，尹杰超 ，Dante Zarlenga ，李廣興，任曉峰*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；3.美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所中心牛功能基因組和動物寄生蟲病實(shí)驗(yàn)室，馬里蘭州 20705）

PRRS病毒（PRRSV）的GP5蛋白是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)[1]。GP5有6個抗原決定簇，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，是理想且常用的免疫原。

白細(xì)胞介素-15（I nterleukin-15，IL-15）是Grabstein于1994年在檢測猿腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液時首次發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子[2]。IL-15的生物學(xué)作用范圍廣泛，如促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞的增殖分化及細(xì)胞毒活性。近來又發(fā)現(xiàn)它以自分泌的方式調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[3]；還可刺激活化的B細(xì)胞分泌抗體。因此，IL-15極具開發(fā)新型免疫佐劑和免疫增強(qiáng)劑的潛力。本試驗(yàn)利用分子克隆方法分別構(gòu)建了表達(dá)豬IL-15和PRRSV GP5基因的重組質(zhì)粒，評價了IL-15對GP5基因免疫的增強(qiáng)效果，為新型疫苗的研制提供了參考數(shù)據(jù)。目前防治PRRSV的主要措施是疫苗接種，而傳統(tǒng)疫苗的存在一定的不足。核酸疫苗的出現(xiàn)為克服弱毒疫苗的易返祖、潛在感染等缺陷和傳染病的防治提供了新思路[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒，工程菌

PMD-18-T-ORF5ORF6質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；PUC-18-IL-15質(zhì)粒由美國農(nóng)業(yè)部Dante Zarlenga博士構(gòu)建；pVAX1、感受態(tài)菌JM109、PRRSV GP5基因等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶和試劑

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（L ipofectamineTMReagent）購自Invitrogen公司；血清購自上海依科賽公司；T4連接酶，各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa大連生物工程公司；飛捷RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自南京凱基公司；PE標(biāo)記的抗鼠CD8+，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗鼠CD4+抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG均購自歐瑞德公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物

6～8周齡昆明小鼠，體重為18～25 g·只-1，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所，實(shí)驗(yàn)鼠分組后按3只·組-1進(jìn)行準(zhǔn)備。

1.2 方法

1.2.1 PRRSV ORF5-pVAX1載體的構(gòu)建及表達(dá)

1.2.1.1 PRRSV ORF5基因的PCR擴(kuò)增

按文獻(xiàn)[5]方法，以質(zhì)粒PMD-18-T-ORF5ORF6基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)了1對引物，同時考慮外源基因的表達(dá)量在基因起始密碼子的前面加入Kozak序列（GCCACC），擴(kuò)增ORF5基因的引物為：

上游引物P1：5′GGGGAAGCTTGCCACCATGT TGGAGAAA3′；

下游引物P2：5′CCCCGGATCCCTAAGGACGA CCCCATTG3′。

在上、下游引物中分別添加了HindⅢ酶切位點(diǎn)和Bam HⅠ酶切位點(diǎn)。

以質(zhì)粒PMD-18-T-ORF5ORF6為模板，擴(kuò)增ORF5基因，反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5μL；dNTP Mixture 4μL；模板2μL；Ex Taq 0.5μL；用ddH2O補(bǔ)至50μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95℃5 min；變性：94℃1 min；退火：41.7℃1 min；延伸：72℃1 min共30 cycles最終延伸72℃10 min。

1.2.1.2 PRRSV ORF5-p VAX1載體的構(gòu)建

按文獻(xiàn)[6]方法，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/Bam HⅠ消化PCR純化產(chǎn)物和pVAX1，分別獲得PRRSV ORF5基因片段和線性載體pVAX1，按照百泰克膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/Bam HⅠ鑒定。

1.2.1.3 重組質(zhì)粒的純化和轉(zhuǎn)染細(xì)胞

質(zhì)粒的小量制備及純化，貯存于-20℃。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用脂質(zhì)體法：將BHK-21細(xì)胞加入裝有細(xì)胞爬片的24孔板培養(yǎng)孔內(nèi)，待細(xì)胞長滿70%～80%時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PRRSV ORF5-pVAX1真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時設(shè)立空載體對照組，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 豬IL-15-pVAX1載體的構(gòu)建及表達(dá)

1.2.2.1 豬IL-15基因的PCR擴(kuò)增

以質(zhì)粒PUC-18-IL-15基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)了1對引物，擴(kuò)增豬IL-15基因的引物為：

上游引物P3：5′GGGGAAGCTTATGAGAATTT TGAAACCA 3′；

下游引物P4：5′CCCCCTCGAGTCAAGAAGTG TTGATGAA 3′。

在上、游引物中分別添加了HindⅢ酶切位點(diǎn)和Xh oⅠ酶切位點(diǎn)。

以質(zhì)粒PUC-18-IL-15為模板，擴(kuò)增豬IL-15基因，反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5μL；dNTP Mixture 4μL；模板2μL；Ex Taq 0.5μL；用ddH2O補(bǔ)至50μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95℃5 min；變性：94℃1 min；退火：48.4℃1 min；延伸：72℃1 min共30 cycles最終延伸72℃7 min。

1.2.2.2 IL-15-pVAX1載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/Xh oⅠ消化PCR純化產(chǎn)物和pVAX1，分別獲得IL-15基因片段和線性載體pVAX1，按照百泰克膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。連接、轉(zhuǎn)化、挑菌、提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/Xh oⅠ鑒定后進(jìn)行測序。

1.2.2.3 重組質(zhì)粒的純化和轉(zhuǎn)染細(xì)胞

方法同1.2.1.3。

1.2.2.4 RT-PCR檢測豬IL-15基因的轉(zhuǎn)錄情況

如1.2.1.3提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后分別用引物P3和P4擴(kuò)增。

1.2.3 小鼠免疫

根據(jù)文獻(xiàn)[7]，用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA，用適量滅菌的0.1 mol·L-1PBS將終濃度調(diào)整到1μg·μL-1。將小鼠隨機(jī)分成7組（見表1），腿部肌肉先注射鹽酸利多卡因50μL·只-1，15 min后再接種質(zhì)粒，分別按以下分組和不同劑量免疫小鼠。每間隔兩周免疫1次，分別于免疫后3 h，7、14、21、28、35及42 d，眼球取血制備血清檢測抗體，并檢測T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量。

表1 核酸疫苗PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1免疫小鼠分組及免疫程序Table 1 Grouping and immunization of mice inoculated with PRRSV ORF5-pVAX1 and pig IL-15-pVAX1

1.2.4 外周血淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)

小鼠眼球采血，加3.8%檸檬酸鈉抗凝劑制備抗凝血，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，2 000 r·min-1離心20 min。收集淋巴細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗2次。細(xì)胞沉淀用1 mL RPMI 1640營養(yǎng)液懸浮，用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活力＞95%，調(diào)整至1×107個細(xì)胞·mL-1。

1.2.5 外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的檢測

按1.2.4制備外周血淋巴細(xì)胞懸液，每份樣品各取500μL，3 000 r·min-1離心5 min沉淀淋巴細(xì)胞。用冷PBS緩沖液（pH 7.4）洗2次，每次3 000 r·min-1離心5 min。然后分別加入1：1 000稀釋的CD4+-FITC標(biāo)記、CD8+-PE標(biāo)記抗體的預(yù)冷PBS 100 μL進(jìn)行反應(yīng)，4℃孵育30 min后，用冷PBS緩沖液（pH 7.4）洗2次，加入500μL緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 ELISA檢測抗體

①將PRRSV ORF5蛋白純化后用0.05 mol·L-1NaHCO3稀釋成50μg·μL-1，加入酶標(biāo)板中，100 μg·孔-1，4℃靜置包被過夜；②用PBST洗板3次，加入200μg·孔-1的封閉液，37℃作用2 h；③PBST洗板3次，加入50倍稀釋的被檢血清樣品，100μg·孔-1，37℃作用1 h；陰性對照孔用未免疫小鼠血清；④PBST洗板3次，加入5 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體100μg·孔-1，37℃作用1 h；⑤加入新配制的顯色液OPD 100 μg·孔-1，37℃閉光作用10 min，加2 mol·L-1硫酸50μL終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測儀上依次讀取490 nm下的OD值。

1.2.7 IFN-γ的檢測摘除眼球取血，收集血清，雙抗夾心ELISA法測定IFN-γ，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有資料均用（X±S）表示，采用多樣本均數(shù)比較的方差分析法。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核重組質(zhì)粒構(gòu)建

利用分子克隆技術(shù)將PRRSV ORF5和豬I L-15基因分別插入到真核表達(dá)載體pVAX1的多克隆位點(diǎn)上，經(jīng)酶切初步鑒定后進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中外源基因序列沒有基因突變、插入及缺失，證明在克隆重組過程中，沒有導(dǎo)致目的基因改變。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后RT-PCR結(jié)果

為證實(shí)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)效果，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后，用試劑盒提取RNA，并進(jìn)行RT-PCR。如圖1所示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，插入的目的基因均可通過RT-PCR方法檢測到，表明重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，說明構(gòu)建的二個重組質(zhì)粒能在真核哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，為開展體內(nèi)試驗(yàn)研究提供依據(jù)。

圖1 PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后RT-PCR結(jié)果Fig.1 RT-PCR product of the recombinate plasmids PRRSV ORF5-pVAX1 and pig IL-15-pVAX1 transfected to BHK-21 cell

2.3 核酸疫苗PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1免疫對外周血CD4+細(xì)胞數(shù)量的影響

核酸疫苗PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1通過肌肉注射免疫小鼠后，用流式細(xì)胞儀對小鼠外周血CD4+細(xì)胞含量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組CD4+細(xì)胞數(shù)量明顯高于PBS對照組和pVAX1對照組，差異極顯著（P＜0.01），表明加佐劑與不加佐劑肌肉注射免疫都誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且加佐劑組明顯高于不加佐劑組，但差異不顯著（P＞0.05）。見圖2。該結(jié)果提示PRRSV ORF5有可能能通過細(xì)胞免疫途徑增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，同時分子佐劑豬IL-15能有效增強(qiáng)該基因疫苗的免疫效果。

2.4 核酸疫苗PRRSV ORF5-p VAX1和豬IL-15-pVAX1免疫后對小鼠外周血CD8+細(xì)胞數(shù)量的影響

核酸疫苗PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1免疫后，用流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血CD細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，加佐劑組外周血CD細(xì)胞數(shù)量明顯高于PBS對照組和pVAX1對照組，差異極顯著（P＜0.01），佐劑組明顯高于不加佐劑組，差異極顯著（P＜0.01）。如圖3。該結(jié)果提示本試驗(yàn)構(gòu)建的基因疫苗在提高細(xì)胞免疫的同時有可能增強(qiáng)抗體生成。也表明IL-15可有效提高T淋巴細(xì)胞的功能。

圖2 PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1核酸疫苗免疫后小鼠外周血CD4+細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.2 Changes of CD4+in peripheral lymphocytes of mice inoculated with PRRSV ORF5-pVAX1 and pig IL-15-pVAX1

圖3 PRRSV ORF5-p VAX1和豬IL-15-p VAX1核酸疫苗免疫后小鼠外周血CD8+細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.3 Changes of CD8+in peripheral lymphocytes of mice inoculated with PRRSV ORF5-p VAX1 and pig IL-15-pVAX1

2.5 ELISA抗體檢測

ELISA抗體檢測結(jié)果見圖4。所構(gòu)建的核酸疫苗均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，且加佐劑組抗體水平明顯高于PBS對照組（P＜0.05），差異顯著，加佐劑組要高于pVAX1對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；同時還發(fā)現(xiàn)，加佐劑組高于PRRSV ORF5-pVAX1單獨(dú)注射組，但是差異不顯著（P＞0.05）。該試驗(yàn)結(jié)果表明PRRSV ORF5基因疫苗能提高體液免疫水平。然而，佐劑分子豬IL-15不能有效地直接提高該疫苗的抗體生成水平。

圖4 PRRSV ORF5-pVAX1和豬IL-15-pVAX1核酸疫苗免疫后抗PRRSV IgG的動態(tài)變化Fig.4 Antibody changes of mice inoculated with PRRSV ORF5-pVAX1 and pig IL-15-pVAX1

2.6 小鼠IFN-γ的檢測結(jié)果

采用雙抗夾心ELISA法檢測小鼠血清中的IFN-γ，檢測結(jié)果見表2。

表2 小鼠血液中IFN-γ的水平(-±S)Table 2 L evel of IFN-γin blood of mice(-±S)

表2 小鼠血液中IFN-γ的水平(-±S)Table 2 L evel of IFN-γin blood of mice(-±S)

注：A-PRRSV ORF5-pVAX1；B-豬IL-15-pVAX1組；C-PR RSV ORF5-pVAX1與豬IL-15-pVAX組；D-pVAX1組；E-PBS組Note:A-PRRSV ORF5-pVAX1;B-Porcine IL-15-pVAX1;C-PR RSV ORF5-pVAX1 and porcine IL-15-pVAX;D-pVAX1;E-PBS

佐劑組小鼠IFN-γ水平明顯高于PBS組和空載體組，差異有顯著性（P＜0.05）。該試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了豬IL-15可有效提高PRRSV ORF5基因疫苗的免疫效果，但以提高細(xì)胞免疫水平為主，而該分子沒有明顯提高疫苗激發(fā)的體液免疫應(yīng)答能力。

3 討 論

IL-15具有與IL-2相似的生物學(xué)功能，但其不良反應(yīng)弱于IL-2。將編碼IL-15的真核表達(dá)載體與PRRSV ORF5-pVAX1疫苗共同免疫小鼠。結(jié)果表明，IL-15真核表達(dá)載體可在增強(qiáng)宿主特異性細(xì)胞免疫功能方面有協(xié)同作用。聯(lián)合注射IL-15-pVAX1與PRRSV ORF5-pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒組抗PRRSV產(chǎn)生能力雖高于單純注射PRRSV ORF5-pVAX1疫苗組，但兩組相比差異無顯著性。說明IL-15在提高體液免疫反應(yīng)方面無明顯增強(qiáng)作用。分析其原因可能是由于IL-15屬于Th1類細(xì)胞因子，可能在誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)增加的同時，通過免疫網(wǎng)絡(luò)抑制了Th2細(xì)胞的活性，因此降低了其體液免疫水平。

研究認(rèn)為，IFN-γ的水平可以反映細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度[8]。在本試驗(yàn)中，接種了PRRSV ORF5-pVAX1疫苗的小鼠血清中，可以檢測到IFN-γ，而PBS及空載體對照組則檢測到很少量。說明本試驗(yàn)所采用的PRRSV ORF5-pVAX1基因疫苗具有免疫原性，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，與國內(nèi)外其他報(bào)道一致[9-10]。核酸疫苗既有亞單位疫苗的安全性，又有弱毒疫苗的有效性，能同時誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，是一種有前景的疫苗[11]。而PRRSV ORF5-pVAX1與豬IL-15-pVAX1共同注射可提高血清中IFN-γ的水平，進(jìn)一步證實(shí)豬IL-15是一個有效的分子佐劑。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功地構(gòu)建了表達(dá)PRRS病毒GP5和豬IL-15的核酸疫苗。通過體外實(shí)驗(yàn)證明該兩種質(zhì)粒可在真核細(xì)胞中的復(fù)制。動物實(shí)驗(yàn)表明PRRSV GP5基因疫苗可有效誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答水平。豬IL-15可作為分子佐劑提高GP5基因疫苗的免疫效果，并以提高其細(xì)胞免疫能力為主要效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果及其評價研究為研制PRRS新型疫苗提供了參考數(shù)據(jù)。

[1]韓銀濤,蘇柏光.豬繁殖與呼吸綜合癥病毒生物學(xué)特性[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(1):33-36.

[2]駱愛芳,郭萬柱,宋振輝,等.豬白細(xì)胞介素-15基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34(10):37-40.

[3]Lovell D.Biologic agents for the treatment of juvenile rheumatoid arthritis:current status[J].Paediatr Drugs,2004,6(3):137-146.

[4]師東方,李一經(jīng),王君偉,等.豬輪狀病毒與傳染性胃腸炎病毒核酸免疫研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(5):605-610.

[5]錢剛,馮力,劉勝旺,等.豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白基因的修飾及原核表達(dá)的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(5):611-614.

[6]任曉峰,李一經(jīng),李廣興,等.豬傳染性胃腸炎病毒S基因桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)重組質(zhì)粒的構(gòu)建[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33(4):359-363.

[7]Sambrook K J,Fritsh E F,Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1992.

[8]Tascon RE,Stavropulos E,Lukacs KV,etal.Protectionagainst Mycobacterum tuberculosis infection by CD8T cells requires the production of gammainterferon IfectImmun[J].1998,66:830-834.

[9]Shimizu M,Yamada S.Changeof lymphocytepopulationsin pigsinfection with porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus[J].Vet Immunol Immunopathol,1996,50:19227.

[10]李華,楊漢春,許勇鋼,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)[J].中國免疫學(xué)雜志,2001,17:208-211.

[11]師東方,賈永清,李一經(jīng),等.昆明鼠對豬輪狀病毒核酸免疫的抗體應(yīng)答[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,35(4):446-448.