胡紅蓮 盧德勛 劉大程 珊 丹 李勝利 張春華 石 巖

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)研究所，呼和浩特010030;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

隨著飼養(yǎng)集約化程度的不斷加強(qiáng)和對產(chǎn)奶量要求的提高，使得亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)成為現(xiàn)代奶業(yè)中危害最大，最常見的疾病之一，造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失，已引起了營養(yǎng)學(xué)界極大的關(guān)注。大量研究表明，無論是急性瘤胃酸中毒還是SARA其發(fā)生的根本原因是動物采食過量或大量的易發(fā)酵碳水化合物飼料。大多數(shù)研究者均采用精粗比進(jìn)行量化研究，肖訓(xùn)軍[1]報道精料水平為70%時誘發(fā)綿羊發(fā)生SARA;常影[2]報道當(dāng)精料水平達(dá) 80%時，誘導(dǎo)閹牛發(fā)生SARA。然而日糧精粗比這一指標(biāo)較為籠統(tǒng)，只能粗略而不能精準(zhǔn)地說明日糧中易發(fā)酵碳水化合物的真正含量和營養(yǎng)物質(zhì)之間相互平衡，因?yàn)椴徽撌蔷线€是粗料各自都包括可發(fā)酵碳水化合物和纖維物質(zhì)，只是比例和含量不同而已。因此，當(dāng)日糧精粗比上升引起瘤胃pH下降時，就很難判斷究竟是由于NFC還是易消化纖維過多造成的。非纖維性碳水化合物(non-fiber carbohydrate，NFC)包括日糧中極易發(fā)酵的碳水化合物部分如淀粉、糖、果膠和有機(jī)酸等在內(nèi)，能夠較為全面體現(xiàn)日糧中易發(fā)酵碳水化合物的含量，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)則能全面體現(xiàn)日糧中纖維物質(zhì)含量。迄今為止，日糧易發(fā)酵碳水化合物的攝入量究竟達(dá)到多大時才能引起反芻動物發(fā)生SARA，改變瘤胃發(fā)酵模式，還鮮有報道，因此有必要對此進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及日糧

選用6只體重30～35 kg的泌乳初期經(jīng)產(chǎn)關(guān)中奶山羊，安裝永久性瘤胃瘺管。試驗(yàn)日糧參照NRC(1981)[3]奶山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合我國奶山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[4]配制，以玉米、豆粕、麥麩、青干草為主要原料，按照日糧中NFC與NDF比例的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4組(分 4期進(jìn)行試驗(yàn))，其NFC/NDF比分別為1.02、1.24、1.63、2.58。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diets (air-dry basis，%)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計與飼養(yǎng)管理

采用自身對照試驗(yàn)設(shè)計，試驗(yàn)動物依次飼喂NFC/NDF比分別為 1.02(Ⅰ期)、1.24(Ⅱ期)、1.63(Ⅲ期)、2.58(Ⅳ期)的4種日糧(即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組)，每期 10 d，包括7 d預(yù)試期和 3 d正試期。試驗(yàn)動物單籠飼養(yǎng)，先喂粗料后喂精料，日喂2次(分別在06:00和18:00)，自由飲水。

1.3 樣品采集與分析測定

1.3.1 瘤胃液的采集與分析測定

每個采樣期分別在飼喂前(0 h)及采食后3、6、9和12 h采集瘤胃液，每次采集20 mL，用4層紗布過濾，濾液經(jīng)3 500 r/min離心 10 min，取4 mL上清液加到裝有1 mL 25%偏磷酸的樣品瓶中用于測定揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，其余上清液留樣備測乳酸，于-20℃冷凍保存。VFA采用GC-7A氣相色譜儀測定(檢測器:FID;色譜柱:柱長2 m、內(nèi)徑3 mm的不銹鋼柱;測定條件:柱溫150℃，汽化室溫度230℃，空氣壓力0.35 kg/cm2，空氣流速140 mL/min，氫氣壓力1.2 kg/cm2，氫氣流速14 mL/min，氮?dú)?載氣)流速 55 mL/min，進(jìn)樣量1 μ L)。乳酸測定方法參照文獻(xiàn)[1]。

1.3.2 血液的采集與分析測定

每個采樣期最后1天分別于飼喂前(0 h)及采食后3、6、9和12 h采集試驗(yàn)羊頸靜脈血10 mL，肝素鋰抗凝，2 000 r/min離心10 min，制取血漿，吸取血漿1 mL，緩慢加入到裝有8 mL蒸餾水的錐形瓶，再加入0.333 mol/L硫酸溶液 0.5 mL，靜置使其酸化完全再加入10%鎢酸鈉溶液0.5 mL，2 500 r/min離心10 min，制得無蛋白血濾液，然后上機(jī)測定VFA含量。

1.3.3 瘤胃pH實(shí)時監(jiān)測

采用動態(tài)pH連續(xù)監(jiān)測記錄系統(tǒng)對測試期每日pH進(jìn)行24 h動態(tài)監(jiān)測。動態(tài)pH連續(xù)監(jiān)測記錄系統(tǒng)主要由pH電極(450 CD，美國Sensorex有限公司生產(chǎn))、pH變送器(692型，美國Jenco有限公司生產(chǎn))和無紙記錄儀(R4100型，浙大中控儀表有限公司生產(chǎn))3部分組成。設(shè)定每隔5 s顯示1次pH，每隔10 min記錄1次pH，將每日所采集的pH數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel進(jìn)行處理分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5版統(tǒng)計軟件中One-way ANOVA過程進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。

2 結(jié) 果

2.1 日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃pH的影響

由圖1和表2可知，瘤胃pH與采食時間呈曲線變化，各期飼喂前瘤胃pH均較高，采食后3～6 h瘤胃pH達(dá)到最低值。同一日糧不同時間點(diǎn)pH隨著采食后時間推移逐漸下降，于3～6 h降到最低值，而后又逐漸上升，周而復(fù)始隨采食時間呈周期性動態(tài)變化。不同日糧同一時間點(diǎn)pH變化基本趨勢為Ⅳ期最低，Ⅲ期低于Ⅱ期和Ⅰ期。隨著日糧NFC含量增加，瘤胃pH下降速率和幅度隨之加大，瘤胃pH平均值、最低值、最大值隨著日糧NFC/NDF比的增加而呈降低趨勢，日糧NFC/NDF比的增加對瘤胃pH＜5.2持續(xù)時間沒有顯著差異(P＞0.05)，但對瘤胃pH＜5.8和6.0持續(xù)時間有顯著的影響(P＜0.05)，瘤胃pH＜5.5持續(xù)時間Ⅳ期顯著高于Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ期(P＜0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期之間沒有顯著差異(P＞0.05)。同一日糧不同pH持續(xù)時間隨pH下降而降低，而不同日糧同一pH持續(xù)時間隨日糧NFC/NDF比的增加而增加。

圖1 日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃pH動態(tài)變化的影響Fig.1 Effects of different dietary NFC/NDF ratios on ruminal pH dynamics in dairy goats

表2 日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃pH最大值、最小值、平均值及pH低于6.0、5.8、5.5、5.2 持續(xù)時間的影響Table 2 Effects of different dietary NFC/NDF ratios on ruminal maximum，minimum，mean values of pH and duration time when pH under 6.0，5.8，5.5 and 5.2 in dairy goats

2.2 日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃VFA及乳酸含量的影響

由表3可知，隨著日糧NFC/NDF比的提高，瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acid，TVFA)、丙酸和丁酸含量均呈現(xiàn)增加趨勢，Ⅳ期達(dá)到最高值，顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期(P＜0.05);丙酸和丁酸含量在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期之間沒有顯著差異(P＞0.05);TVFA 含量除采食后3、6、12 h，Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ期之間沒有顯著差異(P＞0.05)。乙酸含量和A/P變化是隨著日糧NFC/NDF比的提高而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，乙酸含量和A/P以Ⅳ期最低，顯著低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期(P＜0.05)，Ⅱ期乙酸含量和A/P最高，乙酸含量除采食后3、6、12 h，A/P 除采食后3、12 h外，其他時間點(diǎn)在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期之間差異不顯著(P＞0.05)。同一日糧，瘤胃乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量隨采食時間呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，于采食后3～6 h達(dá)到其峰值。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期未檢測到乳酸，Ⅳ期雖檢測到乳酸，但其含量較低，不同時間點(diǎn)均低于 0.1 mmol/L，且差異不顯著(P＞0.05)。

表3 日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃VFA及乳酸含量的影響Table 3 Effects of different dietary NFC/NDF ratios on ruminal VFA and lactate content in dairy goats(mmol/L)

2.3 日糧不同 NFC/NDF比對奶山羊血漿VFA含量的影響

由表4可知，血漿乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量都呈現(xiàn)出隨日糧NFC/NDF比提高而增加的趨勢。在0～3 h，日糧NFC/NDF比提高對血漿乙酸含量沒有顯著影響(P＞0.05)，在采食后6～9 h，Ⅳ期乙酸含量顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期(P＜0.05)，但Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期之間無顯著差異(P＞0.05);Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ期日糧NFC/NDF比對血漿丙酸和TVFA含量無顯著影響(P＞0.05)，Ⅳ期達(dá)到了最高值，顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期(P＜0.05);血漿丁酸含量隨著日糧NFC/NDF比提高而有所提高，但差異不顯著(P＞0.05)。在同一日糧情況下，血漿乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量均隨采食時間呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，于采食后6 h達(dá)到其峰值。

表4 日糧不同NFC/NDF比對奶山羊血漿VFA含量的影響Table 4 Effects of different dietary NFC/NDF ratios on plasma VFA content in dairy goats (mmol/L)

3 討 論

3.1 日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃pH的影響

瘤胃pH是一項(xiàng)反映瘤胃發(fā)酵水平最基本、最重要的指標(biāo)之一，是瘤胃發(fā)酵的“引領(lǐng)者”，對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境相對恒定起到了主導(dǎo)作用。影響瘤胃pH的因素很多，主要包括日糧性質(zhì)、唾液分泌量、有機(jī)酸生成、吸收和排出速度等等，但其波動的根本原因則是日糧結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)水平[5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，瘤胃pH下降速率和下降幅度隨著日糧NFC/NDF比的增大而隨之加大，Ⅳ期表現(xiàn)最為突出，采食后短時間內(nèi)呈線性下降，各時間點(diǎn)pH均顯著低于前3期(P＜0.05)，瘤胃pH最低值不僅出現(xiàn)時間較早，其值也顯著低于前3期(P＜0.05)，這說明瘤胃pH波動幅度隨著日糧NFC/NDF比的增大而明顯加大(表2)。隨著日糧NFC/NDF比的增大，瘤胃pH均值從6.09降至5.66(P＜0.05)，最大值從6.58降至6.22(P＜0.05)，最低值則從5.65降至5.22(P ＜0.05);不僅如此，瘤胃 pH 低于 5.2、5.5、5.8和6.0所持續(xù)時間也在逐漸延長，即瘤胃pH＜6.0持續(xù)時間分別為 9.40、12.16、18.22和20.53 h/d，瘤胃pH＜5.8持續(xù)時間分別為2.42、5.92、11.22和17.06 h/d，瘤胃pH＜5.5持續(xù)時間分別則為0、0.11、0.67和7.50 h/d，這些數(shù)據(jù)表明日糧結(jié)構(gòu)對瘤胃pH產(chǎn)生了顯著的影響。Nocek等[6]研究表明，瘤胃pH下降速率、幅度以及最低值所持續(xù)的時間均隨日糧谷物含量的增加而增加，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)與此結(jié)論一致。

瘤胃pH也是衡量瘤胃酸中毒程度的關(guān)鍵指標(biāo)[6]，目前大多數(shù)研究者將5.2作為衡量急性瘤胃酸中毒發(fā)生時pH閾值[7-8]，而SARA發(fā)生時pH閾值卻存在較大分歧，主要集中于 6.0[9]、5.8[10]、5.5[11]。最新研究常以瘤胃pH平均值、最低值以及低于某個閾值所持續(xù)時間和曲線面積大小來判斷SARA的嚴(yán)重程度[7-8]，但這些閾值所持續(xù)的時間目前還沒有一個統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，瘤胃pH低于6.0、5.8、5.5的持續(xù)時間及曲線面積隨著日糧NFC/NDF比的增加而增加，進(jìn)入Ⅱ期每日有12 h/d以上時間瘤胃處于pH＜6.0的酸性環(huán)境，pH＜5.8長達(dá)5.92 h/d，Ⅲ期每日pH＜6.0長達(dá)18 h/d以上，pH＜5.8也長達(dá) 11 h/d以上。Keunen等[12]報道，奶牛處于 SARA狀態(tài)，瘤胃 pH＜6.0長達(dá)10.5 h以上，若以6.0或5.8作為SARA發(fā)生時pH閾值，本研究進(jìn)入Ⅱ期就意味著試驗(yàn)動物發(fā)生SARA，然而本研究中試驗(yàn)動物在Ⅱ期乃至Ⅲ期均處于健康狀態(tài)，采食正常，無任何亞健康跡象，可見，從本研究結(jié)果判斷，6.0或5.8均不宜作為判定SARA發(fā)生的pH臨界閾值。本研究進(jìn)入Ⅳ期試驗(yàn)動物才表現(xiàn)出明顯的SARA臨床癥狀:精神萎靡，反芻次數(shù)明顯減少，排尿、排糞量減少，且糞便稀軟多呈團(tuán)狀，甚至出現(xiàn)拉稀現(xiàn)象，而且采食量出現(xiàn)較大的波動，剛開始2天其采食量仍較高，達(dá)到1.08 kg/d[13]，隨后幾天急劇下降，甚至個別試驗(yàn)動物出現(xiàn)了拒食。此時瘤胃pH在5.5～5.2之間持續(xù)時間長達(dá)7 h/d以上，但沒有持續(xù)下降到5.2水平以下，瘤胃pH低于5.5的曲線面積也由 0增加到1.09，這表明將5.5和5.2作為SARA發(fā)生時瘤胃pH臨界閾值上限和下限更為準(zhǔn)確?；诒狙芯拷Y(jié)果，當(dāng)瘤胃pH在5.5～5.2之間波動時間持續(xù)長達(dá)7 h/d以上，pH＜5.5曲線面積大于1 pH?h時，標(biāo)志著動物處于SARA狀態(tài)。

3.2 日糧不同NFC/NDF比對奶山羊瘤胃和血液VFA及乳酸含量的影響

VFA含量是瘤胃發(fā)酵的主要指標(biāo)之一，影響其含量變化的最根本因素之一也是日糧結(jié)構(gòu)。本研究中，隨著日糧NFC/NDF比的增加，瘤胃乙酸含量呈現(xiàn)降低的趨勢，而丙酸、丁酸及TVFA含量呈現(xiàn)出增加的趨勢，當(dāng)日糧NFC/NDF比達(dá)2.58時，瘤胃乙酸含量、A/P顯著降低(P＜0.05)，丙酸、丁酸和TVFA含量顯著增加(P＜0.05)，其中丁酸含量增幅最大，這說明NFC含量的變化可以改變瘤胃發(fā)酵類型。一般來說在高精料日糧條件下發(fā)酵應(yīng)為明顯的丙酸型，但在本次試驗(yàn)中雖然A/P的比值有所下降，但并未呈現(xiàn)出明顯的丙酸型，而丁酸顯著增加成為顯著特征。這可能說明丁酸與亞急性酸中毒發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。有研究指出，丁酸酸中毒可能是亞急性酸中毒和急性酸中毒的過渡階段[2]。

血漿中的VFA主要由瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的VFA經(jīng)瘤胃壁吸收而來的，本研究中血漿中TVFA含量及其各組分含量的變化均隨日糧NFC/NDF比的增加而呈現(xiàn)增加的趨勢，這說明日糧結(jié)構(gòu)變化對血漿TVFA含量有著一定的影響。在本研究中血漿TVFA含量是隨瘤胃TVFA含量的增加而增加，但血漿乙酸含量與瘤胃乙酸含量變化趨勢恰好相反，其原因還有待于研究。

乳酸是瘤胃微生物利用底物發(fā)酵產(chǎn)生的另一種酸性物質(zhì)。在正常瘤胃發(fā)酵狀態(tài)下，乳酸并不是瘤胃發(fā)酵的一種重要中間產(chǎn)物，也不被吸收[14]。許多以往的研究證實(shí)，當(dāng)瘤胃發(fā)酵異常時，瘤胃乳酸含量增加是導(dǎo)致急性瘤胃酸中毒的直接原因，但在SARA發(fā)病中的作用卻報道不一。一些研究表明反芻動物發(fā)生亞急性酸中毒時乳酸累積高達(dá)50 mmol/L[15]，但另一些研究表明瘤胃乳酸含量較低，不會超過10 mmol/L[12]或根本不存在[16]。本研究中當(dāng)日糧NFC/NDF比達(dá)2.58時，瘤胃中才檢測到乳酸存在，但其含量很低，低于0.1 mmol/L，這與肖訓(xùn)軍[1]對綿羊研究的結(jié)果相近。乳酸的酸度(pKa=3.1)是 VFA 酸度(pKa=4.8)的 10倍，可見，乳酸雖然是強(qiáng)酸，但因其含量較低不足以使瘤胃pH顯著下降。這說明隨著日糧NFC/NDF比增加，瘤胃pH下降主要源于瘤胃TVFA增多，瘤胃TVFA含量增多是本研究奶山羊發(fā)生SARA的主要原因，而非乳酸。

4 結(jié) 論

①隨著日糧NFC/NDF比的增加，瘤胃pH下降主要源于瘤胃TVFA增多，而非乳酸。

②當(dāng)日糧NFC/NDF比達(dá)2.58，即NFC攝入量為610.5 g，NDF攝入量為236.6 g時，奶山羊發(fā)生SARA。

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