王 敏,李文桂,蔡世飛,周必英

rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸蟲病患者的診斷價值*

王 敏,李文桂,蔡世飛,周必英

目的探討rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸蟲病患者的診斷價值。方法利用純化的rSj26-Sj32融合蛋白和日本血吸蟲成蟲抗原(SjAWA)建立HRP-IgG-Dot-ELISA檢測急性日本血吸蟲病患者血清,并以華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病、棘球蚴病、乙型肝炎、肺結(jié)核病患者和健康人血清作對照,觀察二者的檢測結(jié)果。結(jié)果rSj26-Sj32和SjAWA檢測急性日本血吸蟲病患者陽性檢出率均為100%,特異性分別為95.35%和93.02%;二者均與華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和泡型棘球蚴病患者血清存在不同程度的交叉反應(yīng)。結(jié)論純化的rSj26-Sj32融合蛋白是一種較好的免疫診斷抗原。

日本血吸蟲病;rSj26-Sj32融合蛋白;Dot-ELISA法;免疫診斷

日本血吸蟲病是由日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,Sj)引起的一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病,是國家衛(wèi)生部規(guī)劃防治的五大寄生蟲病之一。中國現(xiàn)癥患者67.12萬人,病牛2.48萬頭,釘螺面積38.01億平方米,受威脅人口4 000萬以上〔1〕。開發(fā)高度敏感和特異的標準化免疫診斷試劑是當前日本血吸蟲病研究的重點內(nèi)容。Sj26是一個較好的診斷抗原分子,王細宏等〔2〕發(fā)現(xiàn)重組Sj26能夠識別抗Sj26的 IgG抗體,通過間接ELISA檢測急性日本血吸蟲病患者血清的敏感性為90.6%,并具有較高的特異性。石佑恩等〔3〕采用酶聯(lián)免疫印漬實驗發(fā)現(xiàn)Sj有31/32kDa(Sj31/32),并證明其具有較高的診斷價值。本研究利用rSj26-Sj32-H RP-IgG-Dot-ELISA檢測急性日本血吸蟲病患者血清,并與日本血吸蟲成蟲粗抗原(SjAWA)H RP-IgG-Dot-ELISA檢測相比較,觀察rSj26-Sj32融合蛋白用于診斷急性日本血吸蟲病的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標本 急性日本血吸蟲病患者血清50份由武漢市衛(wèi)生局王家剛老師惠贈;華支睪吸蟲病患者血清21份、衛(wèi)氏并殖吸蟲病患者血清13份、泡型棘球蚴病患者血清10份、囊型棘球蚴病患者血清9份和肺結(jié)核病患者血清20份由本室保存。正常人血清43份和乙型肝炎患者血清20份由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院羅亞老師惠贈。

1.1.2 試劑及儀器 BL21(pET28α-Sj26-Sj32)重組菌由本室保存,HRP標記的羊抗人IgG購自SouthernBiotech公司,Ni-NTA試劑盒購自QIAGEN公司,酶標儀購自Bio-tek公司,BioRad Gel Doc 1000凝膠成像儀購自Bio-Rad公司,硝酸纖維素膜購自重慶鼎今公司。

1.1.3 Dot-ELISA測定裝置 參照丁建祖〔4〕的方法進行制作。塑料小盒為4cm×3cm×0.6cm的扁盒,分為底、蓋兩部分,蓋中央有直徑0.5cm的圓孔;盒內(nèi)充滿吸水墊料,市售圓筒紙手工折疊而成,蓋孔下緊貼墊料;墊料上放置硝酸纖維素膜(NC膜)一片,硝酸纖維膜片為1.0cm×1.5cm長方形條塊,在pH 為7.4的PBS中浸泡30min,待其自然干燥后裝入測定裝置。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒 pET28α-Sj26GST-Sj32在大腸埃希菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達 經(jīng)鑒定含有重組質(zhì)粒 pET28α-Sj26GST-Sj32的大腸埃希菌BL21(DE3)在含卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中37℃250 r/min振搖培養(yǎng)至A值0.5～0.8時,取適量作為未誘導(dǎo)對照,其余加入終濃度為 1 mmol/L的IPTG 于37 ℃誘導(dǎo)表達,分別在誘導(dǎo)后1、3、5、7、9、11和13 h各收集1 mL菌液。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pET28α-Sj26GST-Sj32表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 上述菌液10 000 r/min離心2min,分別收集菌體,以50μ L的 1×蛋白上樣緩沖液重懸后煮沸5 min,取20μ L用5%的濃縮膠和10%的分離膠進行SDS-PAGE電泳,以考馬斯亮藍染色,脫色后經(jīng)BioRad薄層凝膠掃描分析系統(tǒng)分析重組蛋白的表達情況。

1.2.3 rSj26-Sj32抗原純化 將上述收集的細菌沉淀用 PBS重懸,超聲粉碎后 5 000r/min離心10min,利用pET表達載體攜帶的聚組氨酸(Histag)標簽,用Ni-NTA試劑盒純化,按說明書操作,測定其蛋白濃度為0.21mg/mL,用雙蒸水稀釋至0.1μ g/μ L。分別取不同培養(yǎng)時間誘導(dǎo)表達的重組蛋白20μ L用5%的濃縮膠和10%的分離膠進行SDS-PAGE電泳,以考馬斯亮藍染色,脫色后經(jīng)BioRad薄層凝膠掃描分析系統(tǒng)分析重組蛋白的表達情況。

1.2.4SjAWA制備 日本血吸蟲成蟲粗抗原(AWA),按報道方法制備〔5〕。從感染2 000條日本血吸蟲尾蚴后43d的家兔體內(nèi)收集成蟲,低溫干燥后加入適量PBS,冰浴下磨成勻漿,反復(fù)凍融,低溫離心(10 000r/min)30min,取上清即為AWA,測定蛋白濃度為2.01mg/mL,用雙蒸水稀釋至1μ g/μ L。

1.2.5 rSj26-Sj32和SjAWA抗原包被濃度以及血清稀釋度選擇 在進行Dot-ELISA實驗時,先進行 ELISA 實驗 ,按 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0μ g/孔的rSj26-Sj32融合蛋白包板(抗原包被液200μ L/孔),按 0.2、0.4、0.6、0.8 、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 和 2.4μ g/孔SjAWA 包板;血清按1∶100、1∶200、1∶400和 1∶800稀釋;1∶1 000羊抗人IgG的工作濃度;在常規(guī)操作下檢測10份日本血吸蟲病患者混合血清(陽參)和10份健康人混合血清(陰參),以陽參/陰參的A值之比最大、PBS對照本底最低時選擇為最適條件。將10份日本血吸蟲病患者混合血清和10份健康人混合血清分別以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400和 1∶800稀釋度進行預(yù)實驗,以陽性血清吸光度OD450值與正常對照血清OD450值的比值(S/N)最大時的稀釋度為最佳稀釋度。

1.2.6 rSj26-Sj32/SjAWA-HRP-IgG-Dot-ELISA

每孔NC膜中央點加 rSj26-Sj32融合蛋白 4μ L(0.1μ g/μ L)和 SjAWA 2μ L(1μ g/μ L),室溫干燥;后加入封閉液200μ L,室溫干燥;分別加1∶50待檢稀釋血清100μ L,37℃孵育1h;加入 1∶1 000稀釋H RP-IgG 抗體 100μ L,37℃孵育 30min;加底物液50μ L,37℃孵育 20min;最后加 2mmol/L H2SO450μ L終止反應(yīng)。5min內(nèi)肉眼觀察結(jié)果,若在NC膜上出現(xiàn)紅色斑點為陽性,否則為陰性。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 rSj26-Sj32和SjAWA Dot-ELISA檢測的敏感性和特異性比較用卡方檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒 pET28α-Sj26GST-Sj32在大腸埃希菌BL21(DE3)中的表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒pET28α-Sj26GST-Sj32轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,菌體蛋白的SDSPAGE結(jié)果顯示其分子質(zhì)量單位約為69 kDa,與預(yù)期值相符。薄層掃描分析顯示Sj26GST-Sj32融合蛋白占菌體總蛋白的25%,且在IPTG誘導(dǎo)5 h～7 h蛋白表達量最高(圖1)。

2.2 純化的 rSj26-Sj32的 SDS-PAGE分析BL21(pET28α-Sj26-Sj32)培養(yǎng)至對數(shù)生長期,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)7h的表達產(chǎn)物利用Ni-NTA試劑盒純化,然后進行 SDS-PAGE電泳,純化后的 rSj26-Sj32在約69kDa處有明顯的蛋白表達條帶,其分子量與預(yù)期值相符(圖2)。

2.3 rSj26-Sj32、SjAWA包被濃度和血清稀釋度選擇 在進行ELISA實驗時,rSj26-Sj32和SjAWA 的包被濃度分別為 0.4μ g/孔和 2μ g/孔時,二者的陽參/陰參的A值之比分別為最大;血清稀釋度為1∶50時,其陽性血清吸光度OD450值與正常對照血清OD450值的比值(S/N)最大。因此在進行Dot-ELISA實驗時,rSj26-Sj32和SjAWA的包被濃度分別選擇0.4μ g/孔和 2μ g/孔,血清稀釋度為1∶50。

圖1 重組質(zhì)粒pET28α-Sj26-Sj32表達產(chǎn)物的 SDS-PAGE分析1:蛋白marker;2:未誘導(dǎo)的BL21(pET28α-Sj26-Sj32);3-9:1mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)1,3,5,7,9,11和13小時的BL21(pET28α-Sj26GST-Sj32)產(chǎn)物Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant plasmid pET28α-Sj26-Sj32 expression product1:Protein marker;2:BL21(pET28α-Sj26-Sj32)withoutinduction;3-9:BL21(pET28α-Sj26-Sj32)induced with 1mmol/L IPTG for 1,3,5,7,9,11 and 13h

圖2 rSj26GST-Sj32蛋白純化的SDS-PAGE分析1:蛋白marker;2-5:1mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)1,3,5和7h的BL21(pET28α-Sj26GST-Sj32)產(chǎn)物 6-9 純化的rSj26GST-Sj32蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis ofthepurified rSj26GSTSj32 protein1:Protein marker;2-5:BL21(pET28α-Sj26GSTSj32)induced with 1mmol/L IPTG for 1,3,5 and 7h;6-9:Purified rSj26GST-Sj32 protein

2.4 Dot-ELISA檢測 rSj26-Sj32和SjAWA檢測急性日本血吸蟲病患者的陽性率均為100%,二者檢出率無差異;特異性分別為 95.35%和93.02%;rSj26-Sj32與華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和泡型棘球蚴病患者血清的交叉反應(yīng)率分別為9.52%、15.38%和10.00%,SjAWA與華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和泡型棘球蚴病患者血清的交叉反應(yīng)率分別為14.29%、23.08%和20.00%;兩種抗原均與囊型棘球蚴病、乙型肝炎和肺結(jié)核病人血清未見交叉反應(yīng) (表 1)。rSj26-Sj32-IgG-Dot-ELISA診斷急性日本血吸蟲病的陽性預(yù)告值、陰性預(yù)告值和診斷效率分別為96.15%、100%和97.88%,而SjAWA-IgG-Dot-ELISA診斷急性日本血吸蟲病的陽性預(yù)告值、陰性預(yù)告值和診斷效率分別為94.34%、100%、96.77%。

3 討 論

Ni-NTA中Ni2+有4個共價鍵與NTA結(jié)合,使得Ni與NTA結(jié)合更牢固,脫落率低,可提高蛋白純度并減少Ni2+脫落造成的環(huán)境污染。本研究利用Ni-NTA純化試劑盒對 BL21(pET28α-Sj26-Sj32)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)7 h后收集的表達產(chǎn)物進行純化,獲得純化的蛋白濃度為0.21μ g/μ L,同時純化后的rSj26-Sj32在約69ku處有明顯的蛋白表達條帶,其濃度和分子量均達到實驗要求。

表1 rSj26-Sj32-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸蟲病患者的診斷價值Tab.1 The immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA on patients with acute schistosomiasis japonica

抗體IgG與日本血吸蟲急性感染、慢性感染及再感染關(guān)系密切,急性日本血吸蟲病人的IgG含量與慢性血吸蟲病人相近,均遠高于正常人。檢測特異性IgG具有較高的診斷價值和部分療效考核價值〔6-8〕。王志成等〔9〕發(fā)現(xiàn) rSj26對急性日本血吸蟲病患者血清檢測的陽性率為92%。舒新華等〔10〕用rSj32、SjAWA和SEA分別檢測日本血吸蟲病、華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病患者和健康人血清,發(fā)現(xiàn)rSj32用于檢測日本血吸蟲病的敏感性和特異性與蟲源性抗原AWA和SEA的差異無顯著性。與常規(guī)ELISA比較,Dot-ELISA反應(yīng)時間短,重復(fù)性好,實驗所需血清及酶標抗體用量極少,方法簡便,采用室溫孵育和肉眼觀察判斷結(jié)果,無需特殊儀器,便于大規(guī)模檢測。本研究利用獲得的rSj26-Sj32建立Dot-ELISA法檢測急性日本血吸蟲病患者血清發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為100%,與SjAWA的陽性檢出率一致,特異性分別為95.35%和93.02%,無顯著差異(χ2=0,P＞0.05);rSj26-Sj32和SjAWA均與華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和泡型棘球蚴病患者血清存在不同程度的交叉反應(yīng),但無顯著差異,提示rSj26-Sj32與SjAWA具有相似的敏感性和特異性,表明rSj26-Sj32融合抗原是一種有價值的診斷抗原,值得擴大樣本量進行進一步觀察。

陽性預(yù)測告值是指在人群中對某種疾病進行篩檢時,被試人如為陽性時所患該病的概率。陰性預(yù)測值是指在人群中對某種疾病進行篩檢時,被試人為陰性時無該病的概率。陽性預(yù)測值與診斷試驗的靈敏度和特異度有關(guān)。診斷試驗的特異度越高,陽性預(yù)告值越高;診斷試驗的靈敏度越高,陰性預(yù)測值越高。本研究利用rSj26-Sj32檢測急性日本血吸蟲病患者的陽性預(yù)告值、陰性預(yù)測值和診斷效率與SjAWA的相似,二者無顯著差異。

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Immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA for patients with acute Schistosomiasis japonica

WANG Min,LI Wen-gui,CAI Shi-fei,ZHOU Bi-ying
(Instituteof Infectious and Parasitic Diseases,the First Af f iliated Hospital,
Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

To study the immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA for patients with acute Schistosomiasis japonica,sera from parients were detected by HRP-IgG-Dot-ELISA which established by purified rSj26-Sj32 fusion protein andSchistosoma japonicumadult worm antigen(SjAWA),and compared with detections results of sera from patients with clonorchiasis,paragonimiasis westermani,echinococciasis,hepatitis B and pulmonary tuberculosis,as well as healthy people.It showed that both of the positive rates for rSj26-Sj32 andSjAWA in detection of sera from patients with acute schistosomiasis japonica were 100%,and the specificities were 95.35%and 93.02%,respectively.Moreover,cross reactions different degrees were emerged between sera from patients with clonorchiasis,paragonimiasis westermani and alveolar echinococcosis and both of rSj26-Sj32 andSjAWA.It is suggested that the purified rSj26-Sj32 fusion portein is one of the preferable immunodiagnostic antigen for schistosomiasis japonica.

Schistosomiasis japonica;rSj26-Sj32;Dot-ELISA;immunodiagnosis

R383

A

1002-2694(2010)08-0758-04

*重慶市科委地方病重大專項基金(No.2008AB5055,2008AB5008,2008AB5054)資助

李文桂,Email:Li_wengui@yahoo.com.cn

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所,重慶 400016

2010-02-23;

2010-05-17