趙亞娟 潘樹峰 郭 微

（遼寧省農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)校 沈陽 110000）

RNA干擾技術(shù)在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

趙亞娟 潘樹峰 郭 微

（遼寧省農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)校 沈陽 110000）

RNA干擾是生物進(jìn)化過程中遺留下來的一種在轉(zhuǎn)錄后通過RNA調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制，它是指在真核細(xì)胞中引入雙鏈RNA分子從而導(dǎo)致具有序列同源性的基因產(chǎn)生特異性基因沉默(gene silencing)的現(xiàn)象[1]。2001年和2002年RNAi研究連續(xù)兩年入選美國《科學(xué)》雜志評(píng)定的年度自然科學(xué)十大突破。目前，RNA干擾技術(shù)已成為基因功能研究的有力工具，并在人類疾病模型、基因治療、新藥研發(fā)以及畜牧遺傳育種等諸多領(lǐng)域展示了誘人的應(yīng)用前景。該技術(shù)首先在線蟲和果蠅等低等生物中取得突破，隨之發(fā)展成為基因功能研究的有力工具。由于RNAi機(jī)制具有超越疫苗和抗病毒藥物的諸多優(yōu)點(diǎn)，它也給許多疾病的防治提供了新的思路。

1 RNA i的分子機(jī)制

目前關(guān)于基因沉默的假說認(rèn)為,轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默包括3個(gè)階段:起始、維持、信號(hào)放大與傳播[2]。

1.1 起始階段 包括dsRNA形成、識(shí)別和小干擾RNA( siRNA)片段的產(chǎn)生。由RNA病毒復(fù)制機(jī)制、 源于轉(zhuǎn)基因的雙向克隆形成的發(fā)夾RNA(hpRNA)和反義RNA (asRNA)等克隆技術(shù)均可產(chǎn)生dsRNA[3]，dsRNA被Rde21、Rde24編碼的蛋白識(shí)別并引導(dǎo)后，可被二聚體活性形式的Dicer酶從兩端降解成21～23個(gè)核苷酸的siRNA[4]。

1.2 維持階段 siRNA與RNA酶形成復(fù)合體即RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(R ISC)，后者具有RNA同源性尋找活性和解旋酶活性以解旋dsRNA，該復(fù)合物可被解旋的siRNA激活，鑒別單鏈siRNA序列和降解互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[5]。生化研究表明，多種蛋白因子涉及RISC的形成。Hannon等報(bào)道，在果蠅S2細(xì)胞中分離了500 kD的RISC，但沒有活性，而且他們發(fā)現(xiàn)，即使最純活性形式的R1SC在體外也不具有靶mRNA的切割能力[6]。提示RISC作用的發(fā)揮還需要其他蛋白因子的參與。

1.3 信號(hào)放大與傳播階段 siRNA特異性地與mRNA結(jié)合后，siRNA作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶作用下通過類似PCR的擴(kuò)增作用再次形成dsRNA，新的dsRNA又被RNaseE樣的Dicer內(nèi)切酶切割產(chǎn)生次級(jí)siRNA，次級(jí)siRNA又可以進(jìn)入下一輪循環(huán)。上述形成的siRNA作為信號(hào)被鑒別，在RdRp引導(dǎo)下， siRNA作為 dsRNA擴(kuò)增的誘發(fā)子并以ssRNA作模板，將沉默反應(yīng)放大、增強(qiáng)，在這個(gè)過程中，siRNA可能作為一種信號(hào)分子在植株中系統(tǒng)傳播，誘導(dǎo)更多細(xì)胞啟動(dòng)PTGS，進(jìn)一步放大PTGS效應(yīng)[7]。

2 RNA干擾在動(dòng)物繁殖中的應(yīng)用

在動(dòng)物繁殖領(lǐng)域，RNAi技術(shù)主要應(yīng)用于研究動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育和動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中重要的基因功能及其作用機(jī)制。

2.1 RNAi 與動(dòng)物的生殖細(xì)胞發(fā)育 Wianny等首次將RNAi技術(shù)應(yīng)用于小鼠卵母細(xì)胞研究中，選取在卵泡中表達(dá)的c-mos基因作為靶基因，通過顯微注射方式導(dǎo)入dsRNA，結(jié)果與對(duì)照組基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全相同，即c-mos基因表達(dá)被抑制，細(xì)胞減數(shù)分裂停滯在MⅡ期，說明RNAi可以用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能研究[8]。Jin Han等用RNAi技術(shù)證明了Wee1B蛋白在小鼠卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)，Wee1B蛋白是小鼠卵母細(xì)胞中關(guān)鍵的特異的促成熟因子(MPF)抑制激酶，是維持減數(shù)分裂中止所必需的[9]。Shaoji等首次將RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于精子的生成過程中，用電穿孔法向小鼠睪丸內(nèi)導(dǎo)入外源的報(bào)告基因，然后用同樣的方法導(dǎo)入包含siRNA的DNA載體， 發(fā)現(xiàn)報(bào)告基因的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)期均有不同程度的降低，進(jìn)一步用RNAi 技術(shù)沉默小鼠精母細(xì)胞形成過程中編碼DNA重組酶的內(nèi)源性DMC1(Disruption ofMeiotic Control)基因，顯示DMC1基因沉默后，精母細(xì)胞發(fā)育停滯、不育[10]。

2.2 RNAi與動(dòng)物的胚胎發(fā)育 在發(fā)育過程中的不同階段，特異性地消除基因的功能是RNAi 最大優(yōu)點(diǎn)之一。Wianny等構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠檢測體系，該體系在延伸因子-1a(ET-1a)啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)修飾型綠色熒光蛋白(MmGFP)，將MmGFP的dsRNA注入單細(xì)胞受精卵，體外培養(yǎng)3～4d后，發(fā)現(xiàn)未注射dsRNA的胚胎中大量表達(dá)GFP，而注射組只有6.8%表現(xiàn)出微弱的熒光，說明dsRNA可以抑制GFP的表達(dá)；但在注入c-mos和E-cadherin的dsRNA單細(xì)胞受精卵中，GFP表達(dá)并不受影響，說明dsRNA具有抑制的特異性。Haraguchi等在小鼠受精卵原核中注射Oct4基因的 siRNA表達(dá)載體，體外培養(yǎng)到囊胚期階段檢測到Oct4基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的下降，且胚胎發(fā)育阻滯在囊胚期[11]。

3 RNA干擾在動(dòng)物傳染病預(yù)防上的應(yīng)用

3.1 RNAi與口蹄疫的預(yù)防 Kahana R等[12]利用生物信息學(xué)的方法分析了所有已發(fā)表的FMDV序列，設(shè)計(jì)出3個(gè)至少22bp的siRNA片斷，對(duì)所有FMDV都具有100%親和性。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測感染細(xì)胞中病毒RNA的總量，表明利用siRNA處理的細(xì)胞病毒增殖被抑制。當(dāng)利用3種siRNA的混合物處理細(xì)胞時(shí)，對(duì)病毒的生長產(chǎn)生100%的抑制作用。Liu M等[13]證實(shí)，轉(zhuǎn)染siRNA后12h內(nèi)可以使BHK221細(xì)胞系FMDV的效價(jià)下降10倍～1000倍，且可持續(xù)到轉(zhuǎn)染后第6天。用高感染復(fù)數(shù)FMDV接種L基因的siRNA表達(dá)盒轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞，24h后用間接免疫熒光方法檢測。結(jié)果表明，表達(dá)載體極大地抑制了口蹄疫病毒在BHK細(xì)胞中的復(fù)制，該抑制作用具有序列特異性，并降低了BHK細(xì)胞的死亡率。

3.2 對(duì)流感病毒的干擾作用 PA/ PB基因、NP基因所編碼的蛋白同樣是病毒復(fù)制所不可或缺的因素，選取NP基因和聚合酶基因(PA/PB)中保守序列設(shè)計(jì)的siRNA，對(duì)雞胚和細(xì)胞系中A型IV都有顯著抑制作用。使用這些siRNA處理的感染小鼠，IV感染后肺組織中病毒效價(jià)明顯降低，并能保護(hù)小鼠免于致死量病毒的攻毒[14]。siRNA能保護(hù)動(dòng)物耐過H5/H7等高致病性亞型流感病毒的侵襲。這些結(jié)果說明了RNAi是一種控制流感的有效措施。M蛋白參與病毒粒子的裝配和病毒進(jìn)出細(xì)胞的質(zhì)子通道，慢病毒載體能有效地將M1基因的siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，造成M1蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)抑制，將其與運(yùn)載工具一起靜脈注射到小鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生良好的RNAi作用。

4 RNA干擾在抗動(dòng)物寄生蟲上的應(yīng)用

疫苗接種被認(rèn)為是控制寄生蟲的最有效和最持久的根本策略，使用腸道源的分子來構(gòu)建疫苗抗原已經(jīng)有效地用于家畜的外寄生蟲，如目前投入市場并商品化用于免疫防治牛的重要吸血性蜱微小牛蜱的Bm86基因工程疫苗。利用H11[15]以及H-gal-GP[16]復(fù)合物來免疫防治捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的策略也非常有效，免疫保護(hù)率高達(dá)95%。RNAi技術(shù)的出現(xiàn)為抗寄生蟲藥物有效靶點(diǎn)的篩選和研究新的疫苗開辟了新的途徑。Marcel o等[17]用RNAi研究布氏錐蟲的Trys基因，發(fā)現(xiàn)Trys被抑制后，T(SH2)和GSP被消耗，GSH積聚，細(xì)胞H2O2明顯增加，同時(shí)伴隨著發(fā)育和繁殖受損，因此認(rèn)為Trys可成為抗錐蟲藥物作用的一個(gè)靶點(diǎn)。

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