王 青,張鵬飛,羊小海,王柯敏,武春雷

(湖南大學(xué) 化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室,化學(xué)化工學(xué)院,生物納米與分子工程湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410082)

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展,納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)檢測、生物活性物質(zhì)或細(xì)胞快速分離、藥物可控性定向傳遞和釋放等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景[1-2],因此納米顆粒與細(xì)胞的相互作用受到人們廣泛關(guān)注.納米顆粒與細(xì)胞的相互作用是一個復(fù)雜的過程,該過程除了與納米顆粒本身特性相關(guān),包括納米顆粒形狀[3]、大小[4]、帶電荷量[5]、表面特性[6],以及發(fā)生聚集的能力[7]等;還和細(xì)胞所處的周期以及細(xì)胞類型密切相關(guān).

半導(dǎo)體熒光量子點(Quantum Dots,QDs)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì),如:吸收光譜寬且連續(xù),熒光發(fā)射光譜窄而對稱,光學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng),抗光漂白性能好等[8-9],非常適合用于細(xì)胞生命過程的可視化研究.

本文使用激光共聚焦熒光顯微鏡研究了活細(xì)胞對不同功能化基團(tuán)修飾的量子點的非特異性吸附行為,并考察了量子點濃度、培育時間、培養(yǎng)基中的血清及溫度等因素對其的影響,為進(jìn)一步開展基于量子點的細(xì)胞成像研究與應(yīng)用提供參考.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硒粉(純度 99.5%)、氧化鎘(純度 99.998%)、氧化鋅(純度99%)、三辛基膦(純度90%)、三辛基氧化膦(純度90%)、油酸(純度90%)和硫粉(純度99%)均購自美國Sigma-Aldrich公司;十八胺(純度97%)和十八烯(純度90%)購自比利時Acros公司;1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇2000)(COOH-PEG-PE)、1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-氨基(聚乙二醇2000)(NH2-PEG-PE)和1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲基(聚乙二醇2000)(CH3-PEG-PE)購自美國Avanti lipid公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純,實驗用水均為Millipore超純水(18.2 M Ω·cm).非洲綠猴腎細(xì)胞系(COS-7)為本實驗室?guī)齑?復(fù)蘇后用常規(guī)方法接種于質(zhì)量比為15%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基(加青霉素100 IU/mL,鏈霉素100 IU/mL)中,于 37 ℃,體積比為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),實驗過程中COS-7細(xì)胞分別接種于玻璃底培養(yǎng)皿中.實驗中所用緩沖溶液均為10 mM PBS緩沖溶液(pH=7.4).

FV500-IX70激光共聚焦熒光顯微鏡(日本,Olympus公司);Malvern Zetasizer 3000HS分析儀(英國,Malvern公司);Nu-4750E細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國,Nuair公司);UV-1601紫外-可見分光光度計(日本,Shimadzu公司);F-4500熒光光譜儀(日本,Hitachi公司);CS150GX超高速離心機(jī)(日本,Hitachi公司).

1.2 量子點表面不同功能化基團(tuán)的修飾與表征

參照文獻(xiàn)[10]制備CdSe/ZnS量子點,并對量子點表面進(jìn)行修飾.分別將 COOH-PEG-PE,NH2-PEG-PE,CH3-PEG-PE的氯仿溶液和CdSe/ZnS量子點混合于圓底燒瓶中,控制真空度為0.1 Pa,溫度在37℃,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速為100 r/min,恒溫減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成一層透明薄膜.然后在圓底燒瓶中加入少量的超純水溶解并將溶液移入超速離心管,使用超高速離心機(jī),在10℃,500 000 g條件下離心2 h,取紅色沉淀重新分散在超純水中即可分別得到氨基表面(NH2-PEG-QDs),羧基表面(COOH-PEG-QDs),甲基表面(CH3-PEGQDs)的磷脂膠束修飾的量子點溶液.按文獻(xiàn)[11]的方法對修飾后的量子點進(jìn)行定量,并分別用紫外-可見分光光度計、熒光光譜儀和Zetasizer分析儀對不同功能基團(tuán)修飾的量子點進(jìn)行表征.

1.3 不同功能化基團(tuán)修飾的量子點在細(xì)胞表面的非特異性吸附

將細(xì)胞分別與含有不同濃度量子點(終濃度5～800 nM)的新鮮無血清培養(yǎng)基在37℃培育6 h后,用PBS緩沖液洗滌,加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基,用激光共聚焦顯微鏡成像,以研究量子點濃度的影響.

將細(xì)胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基在37℃培育不同時間(0.5～24 h)后,用PBS緩沖液洗滌,加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基,用激光共聚焦顯微鏡成像,以研究培育時間的影響.

將細(xì)胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基和有血清培養(yǎng)基在37℃孵育18 h后,用PBS緩沖液洗滌,加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基,用激光共聚焦顯微鏡成像,以研究培養(yǎng)基中的血清的影響.

將細(xì)胞分別與含有終濃度100 nM量子點的新鮮無血清培養(yǎng)基在不同溫度條件下(4℃,10℃,25℃,37℃)孵育18 h后,用 PBS緩沖液洗滌,加入1 mL無血清無酚紅培養(yǎng)基,進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡成像,以研究培養(yǎng)溫度的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同功能化基團(tuán)修飾的量子點表征

不同功能化基團(tuán)修飾的量子點的ξ電位分別為(46.4±0.8)mV(NH2-PEG-QDs),(-1.2±0.8)mV(CH3-PEG-QDs)和(-36.1±0.8)mV(COOH-PEG-QDs).這種電位差別是由于顆粒表面修飾的化學(xué)基團(tuán)不同所致:NH2-PEG-QDs因其表面的—NH2在水溶液中質(zhì)子化(—NH+3)而帶正電荷,從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的正電勢;COOH-PEGQDs點表面的—COOH在水溶液中去質(zhì)子化(—COO—)而帶負(fù)電荷,因此呈現(xiàn)出較強(qiáng)的負(fù)電勢;對于CH3-PEG-QDs而言,甲基很難因質(zhì)子化或者去質(zhì)子化而帶電荷,但由于該量子點表面修飾有磷脂分子,而磷脂分子帶有負(fù)電荷,使得CH3-PEGQDs帶少量負(fù)電荷.另外,這三種功能化基團(tuán)修飾的量子點的熒光發(fā)射波長均為580 nm,和未修飾的量子點熒光光譜一致,說明表面修飾沒有對量子點的熒光特性造成明顯影響見圖1.

圖1 不同修飾量子點的吸收光譜與熒光光譜Fig.1 Absorbance and fluorescence spectra of QDs with different modification

2.2 不同功能化基團(tuán)修飾的量子點與細(xì)胞的非特異性吸附

2.2.1 量子點濃度的影響

考察了不同濃度的NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細(xì)胞作用6 h的情況,結(jié)果如圖2所示.其中從左至右量子點濃度分別為5 nM 、20 nM 、50 nM、100 nM 、200 nM、400 nM和800 nM,從上至下分別為NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEGQDs分別與COS-7細(xì)胞作用 6 h的情況.對于NH2-PEG-QDs而言,當(dāng)濃度為50 nM時,細(xì)胞上出現(xiàn)明顯熒光信號,并且隨著量子點濃度的增加而增強(qiáng),細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度也逐漸增加;對于COOH-PEG-QDs而言,當(dāng)濃度達(dá)到100 nM時,可觀察到細(xì)胞上出現(xiàn)熒光信號,其強(qiáng)度也隨著量子點濃度增加而增強(qiáng);而對于CH3-PEG-QDs而言,當(dāng)濃度高達(dá)400 nM 時細(xì)胞上才可觀察到熒光信號.

這3種量子點表面沒有細(xì)胞膜特異性的配體,因此圖2中細(xì)胞上的熒光信號是由量子點與細(xì)胞之間非特異性的靜電吸附所引起的.大多數(shù)細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷,容易吸附表面帶正電荷的量子點(如NH2-PEG-QDs);另外,細(xì)胞膜表面還鑲嵌了各種膜蛋白,有些膜蛋白在生理條件下帶正電荷,會吸附表面帶負(fù)電荷的量子點(如COOH-PEG-QDs);相對而言,表面幾乎不帶電荷的量子點(如CH3-PEG-QDs)與細(xì)胞的非特異性吸附就顯得小些.

2.2.2 共孵育時間的影響

考察了NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細(xì)胞在37℃孵育不同時間的情況,結(jié)果如圖3所示.其中從左至右孵育時間分別為0.5 h、1 h、3 h 、6 h、12 h 、18 h 和24 h,從上至下分別為NH2-PEG-QDs,COOHPEG-QDs及CH3-PEG-QDs與COS-7細(xì)胞在37℃孵育不同時間的情況.隨著孵育時間的增加,均可觀測到細(xì)胞上熒光信號強(qiáng)度的增強(qiáng),說明細(xì)胞上非特異性吸附這三種量子點的量在增加.在相同的時間內(nèi),NH2-PEG-QDs在COS-7細(xì)胞上的吸附最多,其次是COOH-PEG-QDs,CH3-PEGQD的吸附最少.

圖2 量子點濃度的影響孵育溫度為37℃,時間為6h.標(biāo)尺:50 mm.物鏡:20倍Fig.2 Effect of concentration of QDs on QD-cell interactions

圖3 共孵育時間的影響量子點濃度為 100 nM,孵育溫度為37℃.標(biāo)尺:50 mm.物鏡:20倍Fig.3 Effect of incubation time on QD-cell interactions

2.2.3 血清的影響

考察了培養(yǎng)基中血清對不同功能化基團(tuán)修飾的量子點與細(xì)胞作用的影響,結(jié)果如圖4所示.從圖中可以看出,血清的存在可以明顯降低量子點在細(xì)胞上的吸附,這可能是由于血清中的某些成分與量子點發(fā)生非特異性吸附,從而改變量子點表面的電荷與大小,進(jìn)而使得這些量子點難以吸附在細(xì)胞上.

圖4 血清的影響量子點濃度為100 nM,孵育溫度為37℃,孵育時間為18 h;標(biāo)尺:50 μ m;物鏡:20倍Fig.4 Effect of serum on QD-cell interactions

2.2.4 孵育溫度的影響

考察了NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分別與COS-7細(xì)胞在不同溫度下的孵育情況,結(jié)果如圖5所示.從圖可知,孵育溫度對NH2-PEG-QDs與細(xì)胞作用的影響非常明顯:隨著孵育溫度升高,熒光強(qiáng)度明顯增加,說明細(xì)胞上量子點的數(shù)量明顯增加.孵育溫度對COOHPEG-QDs與細(xì)胞作用的影響相對較小,而對CH3-PEG-QD幾乎沒有影響.

一般而言,細(xì)胞與量子點的作用主要包括量子點在細(xì)胞膜表面的吸附和量子點的內(nèi)化兩個階段.當(dāng)細(xì)胞在4℃培育時,由于缺少能量,細(xì)胞的生命活動受到了抑制,此時量子點與細(xì)胞作用主要是在細(xì)胞膜表面的吸附.在37℃培育時,量子點的吸附和內(nèi)化同時發(fā)生,所以在37℃培育溫度下,對NH2-PEG-QDs與COOH-PEG-QDs而言,與細(xì)胞結(jié)合的量子點的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在4℃條件下的結(jié)合量.而CH3-PEG-QD,由于表面ξ電位為(-1.2 ±0.8)mV,既不易吸附在細(xì)胞表面,也不易通過內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞,因此孵育溫度對其與細(xì)胞作用影響不大.

圖5 孵育溫度的影響量子點濃度為100 nM,孵育時間為18 h;標(biāo)尺:50 μ m;物鏡:20 倍Fig.5 Effect of incubation temperature on QD-cell interactions

綜上所述,量子點與細(xì)胞的作用是一個依賴于量子點的濃度、表面電荷、培育時間與溫度,并受培養(yǎng)基中血清影響的耗能過程.該研究工作為進(jìn)一步開展基于量子點的細(xì)胞成像研究與應(yīng)用提供參考.

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