266071 濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院第一療養(yǎng)區(qū) 潘靖

川牛膝為莧科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，主產(chǎn)于四川、云南、貴州等地，具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，利尿通淋之功，用于胞衣不下、關(guān)節(jié)痹痛等[1]。其所含化合物類型主要有脂肪酸類、甾酮類、異黃酮類、齊墩果酸皂苷類化合物。根據(jù)近年來的文獻(xiàn)報(bào)道，蛻皮甾酮有促進(jìn)蛋白質(zhì)同化作用、抗血小板聚集、降低血糖等明顯的生理活性[2-3]，與川牛膝補(bǔ)肝益腎、強(qiáng)筋健骨功效相符。杯莧甾酮(Cyasterone)(圖1)[4-5]在川牛膝中含量較大[6]，可作為代表性藥物進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。因此本文建立高效液相色譜法測(cè)定杯莧甾酮的血藥濃度為其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

圖1 杯莧甾酮的結(jié)構(gòu)式

1 材料、儀器和動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：大耳兔，體重2.0 kg，由湖州市藥檢所提供。實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水，室溫飼養(yǎng)。儀器：Waters高效液相色譜儀(515泵、2487紫外檢測(cè)器)，7725 i手動(dòng)進(jìn)樣閥，針筒式微孔過濾器(0.45 μm，天津市騰達(dá)過濾器廠)，GR-202 AND分析天平，UV-754型紫外可見分光光度計(jì)，80-2臺(tái)式離心機(jī)，XW-80 A渦流混旋器，BDS 160電熱恒溫水溫箱。杭州英譜工作站，AS 3120 A超聲儀。藥品和試劑：對(duì)照品，自制，TLC及HPLC檢測(cè)均為單峰。經(jīng)過UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、CD等測(cè)試鑒定為杯莧甾酮，純度為99.6%(HPLC-ELSD歸一化法測(cè)定)。乙腈、甲醇為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸去離子水。

2 方法

2.1 給藥 采用灌胃法[7]給藥，家兔稱重2.0 kg，按家兔體重25 mg/kg給藥。精密稱取杯莧甾酮對(duì)照品50.0 mg，溶于10 mL蒸餾水中，超聲成混懸液，吸于注射器中給藥。用5 mL蒸餾水清洗注射器。給藥前取血做空白血，給藥后不同時(shí)間取血，HPLC法測(cè)定兔血漿中杯莧甾酮的含量。

2.2 血樣處理 取兔耳緣靜脈血，每次0.5 mL置于2 mL的真空采血管中(內(nèi)含枸椽酸鈉)，加入乙腈2 mL，渦流混旋10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液水浴蒸干，殘?jiān)尤?.1 mL流動(dòng)相超聲溶解，分別過膜，HPLC測(cè)定杯莧甾酮的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得杯莧甾酮的濃度。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取杯莧甾酮11.30 mg，置200 mL量瓶中，加50%甲醇水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得56.5 μg/mL。取上述對(duì)照品溶液5 mL于50 mL量瓶中，用50%甲醇水定容，搖勻，即得 (每1 mL中含杯莧甾酮5.65 μg)。

2.4 杯莧甾酮的紫外可見吸收光譜 取5.65 μg/mL的對(duì)照品溶液，以50%甲醇水作空白，在200～600 nm范圍內(nèi)掃描，得杯莧甾酮紫外可見吸收光譜，可知其在243 nm處有最大吸收。

2.5 數(shù)據(jù)處理 血藥濃度和時(shí)間數(shù)據(jù)由3P87軟件處理。

3 血液中杯莧甾酮的含量測(cè)定

3.1 測(cè)試條件 色譜柱為Symmetry-C18(5 μm，3.9 mm×150 mm)，流動(dòng)相為乙腈20 g、水80 g、磷酸二氫鉀1.36 g，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)243 nm，進(jìn)樣量10 μL。柱溫室溫。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 方法專屬性考察 空白血液、含藥血液樣品和對(duì)照品按3.1項(xiàng)方法各進(jìn)樣10 μL，HPLC圖譜(圖2 A、B、C)。

圖2 色譜圖和線性圖

3.2.2 穩(wěn)定性考察 取處理好的血液樣品，分別于 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 按項(xiàng)方法進(jìn)樣10 μL，計(jì)算杯莧甾酮的峰面積，RSD為2.32%，即樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

3.2.3 線性關(guān)系考察 分別取空白血漿0.5 mL于5個(gè)試管中，分別加入杯莧甾酮對(duì)照品溶液，制成濃度分別為：0.565 μg/mL、1.130 μg/mL、2.260 μg/mL、4.520 μg/mL、9.040 μg/mL。按2.1項(xiàng)下血樣處理過程處理后分別進(jìn)樣10 μL，3針/次，記錄其峰面積。以杯莧甾酮峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，杯莧甾酮的進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，由HS色譜數(shù)據(jù)工作站計(jì)算得杯莧甾酮回歸方程為Y=17 715X＋759.517，r=0.999 0，在 0.565～9.040 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(圖2 D)。

3.2.4 回收率和精密度試驗(yàn) 于空白血液中加入高、中、低3個(gè)不同濃度的杯莧甾酮對(duì)照品液，制備得到分別含杯莧甾酮濃度為 9.040、2.260、0.565 μg/mL血液樣品，測(cè)定3個(gè)濃度血液中杯莧甾酮的回收率分別為：89.7%、90.2%、93.5%，平均回收率為91.1%，RSD=2.25%(n=5)，日內(nèi)精密度RSD=±3.9%，日間精密度RSD=±7.3%。

圖3 杯莧甾酮的血藥濃度-時(shí)間曲線

4 結(jié)果與結(jié)論

家兔經(jīng)口服給藥后，杯莧甾酮在家兔體內(nèi)吸收很快，20 min血液中可檢出杯莧甾酮(圖3)；HPLC法測(cè)定家兔血液中杯莧甾酮的濃度，分離度好，方法簡(jiǎn)便、靈敏，可用于杯莧甾酮的血藥濃度測(cè)定和進(jìn)一步進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

5 討論

1)血樣的處理：作者先后采用多種蛋白沉淀方法，和多種萃取方法，包括甲醇、乙腈、丙酮、高氯酸、硫酸銨等方法。結(jié)果表明，杯莧甾酮提取率在乙腈、甲醇中較高，且在乙腈中提取較干凈、無干擾。因此采用乙腈沉淀蛋白并提取，方法簡(jiǎn)單，提取率又高。

2)本文采用乙腈20 g、水80 g、磷酸二氫鈉1.20 g作為流動(dòng)相測(cè)定兔血漿中杯莧甾酮的濃度，杯莧甾酮的保留時(shí)間為14.4 min，平均回收率為85.5%。本方法操作省時(shí)、簡(jiǎn)便，精密度及重現(xiàn)性均較好[8-11]。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(第一部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：28.

[2]徐楠杰，離月英，李銑.蛻皮甾酮的藥理作用研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，14(4)：300-302.

[3]陳辛，杜德極.拔毒散中抗血小板聚集活性成分[J].中草藥，1996，27(增刊)：63.

[4]Zhou R，Li B G，Zhang G L.Journal of Asian Natural Products Research[J].2005，7(3)：245-252.

[5] 陳幸，黎萬壽，梁溢，等.川牛膝化學(xué)成分的鑒定[J].中草藥，2004，35(9)：978-979.

[6]黎萬壽，陳幸，王曉陽，等.川牛膝的品質(zhì)研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17(4)：18-20.

[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1762.

[8]陳幸，黎萬壽，崔紅，等.酶高效液相色譜法測(cè)定獨(dú)活寄生合劑中杯莧甾酮含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23(8)：451-452.

[9]黎萬壽，陳幸，王曉陽，等.RP-HPLC法測(cè)定白毛夏枯草中杯莧甾酮的含量[J].中草藥，2002，33(10)：898-899.

[10]馬英，畢開順，王璽，等.HPLC法測(cè)定川牛膝中杯莧甾酮的含量[J].中草藥，2000，31(6)：427-428.

[11]陳幸，黎萬壽，朱久武，等.RP-HPLC法測(cè)定川牛膝中杯莧甾酮的含量[J].藥物分析雜志，2000，20(4)：234-235.