蘆 鑫 程永強(qiáng) 李里特

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

研究蛋白質(zhì)凝聚凝膠的技術(shù)進(jìn)展

蘆 鑫 程永強(qiáng) 李里特

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

由于蛋白質(zhì)形成的凝膠會(huì)影響食品的質(zhì)構(gòu)和品質(zhì),所以研究蛋白質(zhì)凝膠對(duì)于食品科學(xué)有極其重要的意義。然而,蛋白質(zhì)形成凝膠的機(jī)理過(guò)于復(fù)雜,需要更先進(jìn)的技術(shù)來(lái)研究。介紹了用于蛋白質(zhì)凝膠研究的最新技術(shù)進(jìn)展,如原子力顯微鏡 (AF M),共聚焦激光顯微鏡 (CSLM)和漫射波光譜 (DWS)。與傳統(tǒng)研究凝膠的方法如動(dòng)態(tài)流變儀和掃描電子顯微鏡 (SEM)相比,這些新方法簡(jiǎn)化了樣品的預(yù)處理,有實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)測(cè)定的可能。由于樣品處于天然狀態(tài),所以反映的信息更具有真實(shí)性,加上高分辨率,可以實(shí)現(xiàn)蛋白形成凝膠過(guò)程分子水平的可視化。因此,采用以上的新技術(shù)可以為研究蛋白凝膠的形成提供更多的信息。

AFM DWS CSLM 蛋白凝膠

凝聚和凝膠過(guò)程對(duì)食品加工起著重要的作用,它們能形成食品所需要的質(zhì)構(gòu),也會(huì)帶來(lái)不需要的沉淀或是分層現(xiàn)象。因此,研究膠體形成的特性對(duì)于穩(wěn)定和形成食品所需結(jié)構(gòu)十分重要,并且通過(guò)控制凝膠反應(yīng)優(yōu)化食品加工過(guò)程,提高食品品質(zhì)。

對(duì)于食品體系的凝膠和凝聚已經(jīng)有了深入的研究,但凝聚凝膠現(xiàn)象還鮮有報(bào)道。因?yàn)檠芯磕z過(guò)程有以下困難:首先,蛋白和多糖是大分子,三維結(jié)構(gòu)描述和定量困難。其次,凝膠過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)體系[1]。例如,球蛋白的凝膠過(guò)程,通常分為蛋白分子展開(kāi),解聚和聚合,凝聚[2]的步驟。在熱變性的過(guò)程中,天然蛋白分子伸展,暴露出功能性基團(tuán)(如巰基和疏水基團(tuán))。隨后,為了降低體系的能量,蛋白通過(guò)形成二硫鍵或疏水相互作用發(fā)生凝聚[3-4]。當(dāng)?shù)鞍诐舛雀哂谛纬赡z的臨界點(diǎn)時(shí),凝聚繼續(xù)發(fā)展形成凝膠結(jié)構(gòu)。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中,最終的凝膠和凝聚體的結(jié)構(gòu)受環(huán)境因素影響 (蛋白濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度等)很大。食品是個(gè)復(fù)雜的體系,一些成分會(huì)影響蛋白凝聚凝膠的過(guò)程如蛋白—蛋白的相互作用,通過(guò)改變二硫鍵形成、疏水相互作用、氫鍵或是范德華力,改變形成凝膠體的凝膠特性[5]。

此外,采用傳統(tǒng)的分析手段難以獲得更加深入真實(shí)的凝膠形成信息。盡管采用動(dòng)態(tài)流變儀、顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)可以分析凝膠形成過(guò)程,但是這些方法主要通過(guò)分析凝聚發(fā)生過(guò)程時(shí)粒子尺寸或是彈性模量 G′的變化來(lái)進(jìn)行研究[6-9],通常需要復(fù)雜繁瑣的樣品前處理過(guò)程,如稀釋、機(jī)械變形、干燥、凍干等,這些處理會(huì)破壞易破碎的弱凝膠,影響亞穩(wěn)定體系。因此,保持體系接近原始天然狀態(tài)對(duì)于考察物理化學(xué)因素對(duì)于凝膠最終質(zhì)構(gòu)的影響十分重要。理想的分析方法應(yīng)該是非破壞性的、非干擾性的技術(shù),可以讓樣品處于天然狀態(tài)下測(cè)定,從而獲得處于軟凝膠狀態(tài)下,凝膠相互作用的信息[10]。

伴隨科技的發(fā)展,一些新的非破壞性的技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)凝膠和凝聚的研究中。文章論述了原子力顯微鏡 (AFM),激光共聚焦顯微鏡 (CSLM)和散射光波譜 (DWS)用于食品蛋白質(zhì)凝聚凝膠的研究。在我國(guó),雖然原子力顯微鏡已經(jīng)廣泛用于多糖結(jié)構(gòu)的研究[11-13],但是用于蛋白質(zhì)凝膠和凝聚的研究報(bào)道還很少。

1 AFM用于蛋白質(zhì)凝聚凝膠

AFM起源于隧道掃描顯微鏡技術(shù),它廣泛應(yīng)用于生物、物質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域。AFM用于食品科學(xué)中以下六個(gè)方面[14]:AF M可以定性描述食品大分子的結(jié)構(gòu);通過(guò) AFM成像提供的結(jié)構(gòu)參數(shù)描述食品加工和儲(chǔ)存過(guò)程中定量分析分子結(jié)構(gòu)變化;顯示不同分子之間的相互作用;為操控食品大分子提供條件;描述食品表面因物理特性變化而帶來(lái)的細(xì)微變化;加工納米食品的工具。

1.1 AFM的原理

AFM的成像是通過(guò)“感覺(jué)”而非“觀(guān)察”樣品。在A(yíng)FM觀(guān)測(cè)樣品時(shí),一個(gè)安裝在懸臂上的尖端掃描樣品表面,通過(guò)記錄懸臂的偏斜,通過(guò)激光二極管發(fā)出的激光照射在懸臂的末端,經(jīng)過(guò)鏡面反射把激光發(fā)射到光電二極管檢測(cè)器上,得到懸臂偏斜的信號(hào)。當(dāng)掃描樣品時(shí),樣品表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)通過(guò)尖端和樣品力的變化使懸臂發(fā)生偏斜。通過(guò)電腦處理懸臂偏斜變化形成樣品表面三維結(jié)構(gòu)[15]。

AFM的觀(guān)測(cè)模式有三種:接觸、非接觸和輕敲。在接觸模式中,尖端始終與樣品表面接觸,而非接觸模式中,懸于空氣中的尖端僅于樣品表面吸附水層接觸而不與樣品接觸。輕敲模式中,尖端與樣品間歇接觸,通常每秒接觸 300 000次,減少接觸模式中產(chǎn)生的剪切力對(duì)于樣品的破壞,這種模式通常適宜那些質(zhì)地偏軟的食品和生物樣品。

1.2 AFM的特點(diǎn)

與傳統(tǒng)的電子和普通光學(xué)顯微鏡相比,AFM具有以下優(yōu)點(diǎn)[14,16]。

①具有高分辨率和大的放大倍數(shù)。AFM沒(méi)有透鏡,因此不受衍射極限或者球面像差的限制,對(duì)于某些樣品可以實(shí)現(xiàn)原子級(jí)別的分辨率。

②簡(jiǎn)化樣品處理的過(guò)程。AFM是非破壞的分析方法,不需要染色或是覆膜處理,也不用高能量的粒子流,不需要導(dǎo)電襯底,不受樣品稠度的影響,觀(guān)測(cè)時(shí)樣品可以處于溶液中,基本達(dá)到在天然狀態(tài)下或是近似天然狀態(tài)下觀(guān)測(cè)樣品。

③可同時(shí)得到樣品的二維和三維成像。

④可以連續(xù)的觀(guān)測(cè)樣品變化,所以可以直接觀(guān)測(cè)正在進(jìn)行的反應(yīng)過(guò)程。如酶反應(yīng)的過(guò)程。

⑤為操控大分子和調(diào)查大分子之間的相互作用提供了可能。

然而,目前 AFM也有以下缺點(diǎn):相對(duì)較小的掃描面積,較慢的掃描速度,對(duì)于過(guò)于軟的樣品成像困難等

1.3 AFM在蛋白凝聚和凝膠上的應(yīng)用

AFM能有效地提供凝膠結(jié)構(gòu)信息,進(jìn)而補(bǔ)充流變儀或化學(xué)分析蛋白凝聚結(jié)構(gòu)信息。AFM可以成功的反映乳清蛋白熱凝聚現(xiàn)象,研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白凝聚體顯示了同β-乳球蛋白凝聚體相似的微觀(guān)結(jié)構(gòu)[17]。在 pH 7時(shí),無(wú)論 NaCl濃度如何變化,乳清蛋白凝聚體主要由橢球形微粒構(gòu)成。以上研究結(jié)果對(duì)于理解不同條件下得到的熱導(dǎo)致乳清蛋白凝膠特性差異提供了基礎(chǔ)。

采用輕敲模式 AFM觀(guān)察到加熱后β-乳球蛋白,發(fā)現(xiàn)它形成一種有規(guī)律的纖維結(jié)構(gòu),長(zhǎng)度約 25 nm,厚度是 1或 2個(gè)蛋白單體[14]。這證明在低 pH低離子強(qiáng)度下,形成的熱導(dǎo)致β-乳球蛋白纖維體需要進(jìn)行兩步以上的反應(yīng)。

I

wasaki等[14]采用 AFM分析加熱對(duì)于肌漿球蛋白絲形態(tài)的影響,發(fā)現(xiàn)在 70℃時(shí)原來(lái)的串珠結(jié)構(gòu)變成繩子結(jié)構(gòu),但是少量蛋白絲的結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化。Yang等[18]使用 AFM觀(guān)察鯰魚(yú)凝膠結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)鯰魚(yú)凝膠中具有平均直徑為 118 nm的環(huán)形孔洞球形凝聚體的平均直徑為 267 nm。他們認(rèn)為球狀凝聚體和環(huán)形孔洞的形成與水和離子滲透過(guò)正在水解膠原質(zhì)時(shí)的方式有關(guān)。

AFM能從分子水平上解釋食品流變學(xué)特性的差異,從力學(xué)的角度揭示蛋白凝聚特性。I wasaki等[19]報(bào)道了采用 AFM分析由熱導(dǎo)致和壓力導(dǎo)致的細(xì)絲狀肌漿球蛋白凝膠中的串珠結(jié)構(gòu)和彈性之間的關(guān)系。近期出現(xiàn)的階段成像,力調(diào)制模式等新技術(shù),使AFM能夠定量測(cè)定物質(zhì)彈性。

AFM也應(yīng)用于分析蛋白凝聚動(dòng)力學(xué)。Yay等[20]使用AFM分析采用 GDL導(dǎo)致不同大豆蛋白凝聚的過(guò)程。將 11S、7S、2S在 100 ℃加熱 10 min后,加入GDL,采用AFM觀(guān)測(cè)它們形成不同的凝聚曲線(xiàn)。單位時(shí)間內(nèi),11S形成體積最大的凝聚團(tuán),2S形成的凝聚團(tuán)其次,7S的凝聚團(tuán)最小,所以可以推測(cè) 11S的凝聚速度最快,7S最小。

雖然AFM已經(jīng)成功地運(yùn)用于食品蛋白凝膠領(lǐng)域,但是對(duì)于觀(guān)測(cè)高度復(fù)雜的真實(shí)食品體系,還存在不足,有太多其他組分和組分間相互作用會(huì)干擾對(duì)調(diào)查對(duì)象的分析。但是隨著技術(shù)的發(fā)展,AFM必然會(huì)廣泛的應(yīng)用于真實(shí)的食品體系。

2 CSLM用于蛋白凝聚凝膠

與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比,由于采用自動(dòng)的顯微鏡技術(shù)、熒光探針技術(shù)、高容量和高強(qiáng)度的圖片處理軟件等先進(jìn)技術(shù),CSLM具有很高的放大倍數(shù)和高的分辨率。CSLM已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)[21]、免疫學(xué)、藥劑學(xué)[22]、基因?qū)W、生理學(xué)[23]等領(lǐng)域。

2.1 CSLM的原理

利用激光束通過(guò)光柵針孔形成點(diǎn)光源,在熒光標(biāo)記標(biāo)本的焦平面上逐點(diǎn)掃描,采集點(diǎn)的光信號(hào)通過(guò)探測(cè)針孔到達(dá)光電倍增管 (PMT),再經(jīng)過(guò)信號(hào)處理,在計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上形成圖像。CLS M采用共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了 1個(gè)帶有小孔的擋板,平面以外的雜散光被擋住,消除了球差,并進(jìn)一步消除了色差,且可將樣品分解成二維或三維空間上的無(wú)數(shù)點(diǎn),用十分細(xì)小的激光束 (點(diǎn)光源)逐點(diǎn)逐行掃描成像,再通過(guò)微機(jī)組合成 1個(gè)平面的或立體的圖像[24-25]。

2.2 CSLM的特點(diǎn)

CSLM已經(jīng)逐漸用于食品微結(jié)構(gòu)的研究,有如下特點(diǎn)[26]:避免固定或者脫水操作,避免破壞樣品,因此減少了樣品制備的時(shí)間和對(duì)樣品性質(zhì)的改變;熒光探針的使用可以特定觀(guān)察食品的某種成分,提高檢測(cè)的靈敏性和特異性;食品結(jié)構(gòu)的變化可以連續(xù)的監(jiān)測(cè);“光切片”技術(shù)可以確保不破壞微觀(guān)結(jié)構(gòu)的條件下,觀(guān)測(cè)表面以下不同深度切面的微觀(guān)結(jié)構(gòu)。

雖然 CSLM有諸多優(yōu)點(diǎn),但是 CSLM還有以下缺點(diǎn):受衍射極限的限制,CSLM觀(guān)測(cè)某些蛋白和酪蛋白膠束的分辨率最高達(dá)到 0.2μm以上;同時(shí)某些與樣品采用共價(jià)鍵結(jié)合的熒光探針會(huì)改變樣品結(jié)構(gòu)的影響[27]。此外,熒光信號(hào)逐漸減弱,會(huì)影響測(cè)定結(jié)果;掃描速度慢,并且目前 CSLM不能檢測(cè)靜止的食品體系。

3.良種繁育體系建設(shè)還需要進(jìn)一步加強(qiáng)，畜牧業(yè)服務(wù)體系建設(shè)滯后，養(yǎng)豬科技創(chuàng)新與支撐能力有待于進(jìn)一步提高。

2.3 CSLM在蛋白凝聚凝膠中的應(yīng)用

由于 CSLM適宜觀(guān)察處于天然狀態(tài)下食品體系[28],所以 CSLM已經(jīng)用于分析食品膠體,如蛋白 -多糖相分離,蛋白凝膠結(jié)構(gòu),乳化和泡沫穩(wěn)定性[29-34]。

CSLM可以用于測(cè)定膠體形成動(dòng)態(tài)過(guò)程[26]。CSLM已經(jīng)觀(guān)測(cè)了采用凝乳酶導(dǎo)致全脂牛奶和低脂牛奶形成凝膠的過(guò)程。起初,酪蛋白呈現(xiàn)出粒徑小于 0.5μm細(xì)微分散的小顆粒,15 min后,酪蛋白顆粒開(kāi)始發(fā)生凝聚,最終凝膠形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。從CSLM分析發(fā)現(xiàn),除了在低脂牛奶中脂肪球個(gè)數(shù)遠(yuǎn)少于全脂牛奶和凝膠速度低于全脂牛奶以外,低脂牛奶和全脂牛奶凝膠過(guò)程相似。采用 CSLM觀(guān)測(cè) GDL導(dǎo)致的凝膠過(guò)程時(shí),發(fā)現(xiàn)在加入 GDL后 1-20 min(pH 6.51～5.64),一些粒徑小于 1μm蛋白微粒在各個(gè)方向上隨機(jī)快速運(yùn)動(dòng),30 min后,pH下降到5.58時(shí),粒徑小于 2μm牛奶蛋白的凝聚體成為體系的主體。開(kāi)始發(fā)生凝膠化并形成可見(jiàn)的蛋白網(wǎng)絡(luò)是在 pH 5.4,而此時(shí)蛋白已經(jīng)完全靜止。

CSLM能夠清楚的描述在凝聚凝膠過(guò)程中大分子之間的相互作用,如多糖—蛋白、蛋白—蛋白。Sittikijyothin等[35]使用 CSLM研究由β-乳球蛋白和他拉膠形成的混合膠。單純的β-乳球蛋白凝膠呈現(xiàn)均質(zhì)性,而混合膠具有兩個(gè)相。β-乳球蛋白發(fā)生凝聚后,形成富含蛋白的連續(xù)相,他拉膠構(gòu)成分散相。他拉膠濃度顯著影響混合膠的微觀(guān)結(jié)構(gòu),當(dāng)增加他拉膠濃度時(shí),會(huì)產(chǎn)生更具有開(kāi)放性和不均勻的混合膠結(jié)構(gòu)。Gon?alves等[36]研究由β-乳球蛋白和刺槐豆膠形成混合膠也具有相似的結(jié)構(gòu)[36]。

Schmitt等[37]采用 CSLM研究發(fā)現(xiàn):總濃度為1%的β-乳球蛋白和阿拉伯膠,與總濃度 1%的全溶β-乳球蛋白和阿拉伯樹(shù)膠形成的凝膠完全不同。球狀混合聚集物的沉淀平衡系數(shù)受構(gòu)成聚集層的兩種物質(zhì)比例的影響。當(dāng)?shù)鞍诐舛壬仙龝r(shí),產(chǎn)生尺寸巨大、數(shù)量眾多沉淀,這些沉淀由阿拉伯樹(shù)膠包圍的蛋白質(zhì)凝聚團(tuán)組成。而凝聚團(tuán)由含有單個(gè)小泡顆粒(氣泡表觀(guān)直徑 4～10μm)和含有泡沫顆粒 (氣泡大小相對(duì)均一,直徑在 2～4μm)構(gòu)成。在全溶β-乳球蛋白和阿拉伯樹(shù)膠形成分散體系中主要是含有單個(gè)氣泡的顆粒團(tuán)。產(chǎn)生不同微粒的原因是:β-乳球蛋白和全溶β-乳球蛋白的分散性不同造成的。

CSLM提供了加熱乳清蛋白和β-乳球蛋白可以形成復(fù)雜的凝膠網(wǎng)絡(luò)的證據(jù)。疏水相互作用和氫鍵誘導(dǎo)β-乳球蛋白分子吸附到乳清蛋白上[39]。這一點(diǎn)在 CSLM的照片上可以清楚地看到二者的熒光信號(hào)重合在相同的區(qū)域。此外,CSLM還顯示β-乳球蛋白對(duì)于乳清蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的影響,當(dāng)降低β-乳球蛋白的含量時(shí),形成的混合凝膠網(wǎng)絡(luò)更均勻。

動(dòng)態(tài) CSLM也成功地用于分析環(huán)境因素如離子強(qiáng)度、pH、時(shí)間等對(duì)于凝膠結(jié)構(gòu)的影響。采用動(dòng)態(tài)CSLM可以清楚地觀(guān)測(cè)到離子強(qiáng)度和 pH對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響。在低離子強(qiáng)度和高 pH條件下,CSLM觀(guān)測(cè)到酪蛋白形成帶有大孔洞的粗糙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),而在高的離子強(qiáng)度和低的 pH條件下,形成蛋白網(wǎng)絡(luò)比較均勻,孔洞尺寸較小[39]。這是由于酪蛋白在高離子強(qiáng)度下的去穩(wěn)定化要慢于低離子強(qiáng)度,并且需要更低的 pH條件來(lái)減少膠束表面的電荷,所以形成凝膠的速度較慢,容易形成結(jié)構(gòu)精細(xì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3 DWS用于蛋白凝聚凝膠

DWS起源于傳統(tǒng)的激光散射技術(shù)。由于多散射光子疊加,使傳統(tǒng)的靜態(tài)或是動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)都不能用于高濃度的膠體體系,只能分析稀釋的懸濁體系,其濃度大約 0.01%。而凝膠化、相分離和絮凝現(xiàn)象發(fā)生的濃度,都高于激光散射測(cè)量的濃度范圍[40]。但 DWS卻可以用于混濁的膠體體系,因此,DWS可以用于研究乳化劑、膠體、化妝品等領(lǐng)域。

3.1 DWS的原理

當(dāng)激光照射到組成膠體的顆粒上時(shí),導(dǎo)致發(fā)生共振和散射,而且散射光受顆粒運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響[41]。DWS測(cè)定的是在顆粒間發(fā)生多次散射光子,這時(shí)光子的運(yùn)動(dòng)途徑可以看作隨機(jī)運(yùn)動(dòng)或是散布運(yùn)動(dòng)。因此,隨時(shí)間變化的散射光強(qiáng)度直接與樣品中顆粒運(yùn)動(dòng)狀態(tài)有關(guān),測(cè)定散射光變化,即可推出顆粒運(yùn)動(dòng)狀態(tài),進(jìn)而得出凝聚的狀態(tài)。

DWS有兩種構(gòu)造類(lèi)型:同側(cè)型和穿透型,同側(cè)型,收集器和檢測(cè)器與激光發(fā)射源在同一側(cè);穿透型收集器和檢測(cè)器與激光發(fā)射源在異側(cè),所以散射激光必須穿過(guò)整個(gè)懸濁樣品,散射激光的強(qiáng)度較高。同側(cè)型的缺點(diǎn)是有時(shí)收集的散射光沒(méi)有發(fā)生足夠散射,但是它具有激光能量低并且易于安裝設(shè)備的優(yōu)點(diǎn),因此用于食品凝聚凝膠化的研究。

3.2 DWS的特點(diǎn)

DWS可以在線(xiàn)測(cè)定未稀釋或是未預(yù)處理過(guò)樣品,得到凝聚顆粒的尺寸、空間相關(guān)性的信息。但缺點(diǎn)是:DWS不能用于已經(jīng)完全形成的凝膠,因?yàn)榇藭r(shí)顆粒已經(jīng)完全靜止,體系中沒(méi)有微粒移動(dòng),就不能用復(fù)雜的相關(guān)函數(shù)來(lái)推導(dǎo)凝膠的信息。目前沒(méi)有商業(yè)化DWS設(shè)備,只是一些實(shí)驗(yàn)室自制的 DWS設(shè)備。因此,DWS的發(fā)展受軟件和硬件的限制。

3.3 DWS在蛋白質(zhì)凝膠凝聚中的應(yīng)用

目前,DWS主要用于研究初始狀態(tài)下的食品凝聚凝膠化過(guò)程,如通過(guò)添加凝乳酶或酸化導(dǎo)致牛奶凝膠化過(guò)程,并測(cè)定凝膠網(wǎng)絡(luò)的黏彈性[42-44]。

研究表明,DWS能夠準(zhǔn)確測(cè)定凝結(jié)時(shí)間,并且能找到散射光強(qiáng)度變化和形成結(jié)構(gòu)彈性之間的聯(lián)系。DWS通過(guò)測(cè)定光子運(yùn)動(dòng)平均自由行程 (l3)的變化,發(fā)現(xiàn)使用凝乳酶和酸凝固的酪蛋白凝膠差異明顯。參數(shù) l3是穿透性 DWS特有的表征微觀(guān)結(jié)構(gòu)發(fā)展變化和不同類(lèi)型凝膠形成機(jī)理的指標(biāo)。凝膠化過(guò)程中,l3的變化要早于顆粒凝聚尺寸變化和流變學(xué)變化。在酸化和凝乳酶誘導(dǎo)的凝膠體系中,隨時(shí)間變化,兩者的 l3不同,所以證明在兩種凝膠化過(guò)程中蛋白質(zhì)間不同的相互作用類(lèi)型[45]。

即使在發(fā)生凝結(jié)之前,DWS顯示在光子平均自由行程上加熱和未加熱的牛奶有明顯的差別[46]。在加熱后的牛奶體系中,從加入酸化劑到 pH下降到5.5時(shí),酪蛋白膠束表觀(guān)半徑逐漸呈現(xiàn)線(xiàn)性下降了20 nm。當(dāng) pH到達(dá) 5.4時(shí),顆粒的表觀(guān)半徑開(kāi)始逐漸緩慢上升,直到 pH到達(dá) 5后,顆粒的表觀(guān)半徑爆炸性增長(zhǎng)。而在未加熱牛奶中 l3在 pH 5.4就已經(jīng)有相當(dāng)大的增加,而此時(shí)顆粒尺寸并沒(méi)有較大的變化,這就意味著在這個(gè)體系中,顆粒間存在力的相互作用早于形成凝聚。這種相互作用在加熱后的牛奶中表現(xiàn)更為明顯,當(dāng)開(kāi)始酸化 pH為 6.0以上,顆粒的尺寸沒(méi)有變化時(shí),顆粒間的相互作用就已經(jīng)表現(xiàn)出來(lái)了。以上結(jié)果表明,加熱牛奶中的酪蛋白膠束在未發(fā)生凝聚時(shí),已經(jīng)被乳清蛋白和κ-酪蛋白形成的微弱的凝膠網(wǎng)絡(luò)限制了移動(dòng),并最終發(fā)生凝聚。這一假設(shè)通過(guò)使用改變牛奶中酪蛋白膠束和乳清蛋白比例,得以驗(yàn)證[47]。

采用 DWS研究酪蛋白膠束表明,只有當(dāng)凝乳酶水解掉 90%以上的κ-酪蛋白后,酪蛋白膠束才開(kāi)始凝聚[48]。只要有少量“毛發(fā)”κ-酪蛋白存在,以及體系中殘留乳清蛋白的存在,就能阻止酪蛋白膠束的凝聚。DWS研究發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理過(guò)的酪蛋白膠束通過(guò)分子內(nèi)部的相互作用,也能阻止凝乳酶導(dǎo)致的凝聚發(fā)生[49]。

4 結(jié)論

概括了AFM、CSLM和 DWS在食品蛋白質(zhì)凝聚凝膠研究中的應(yīng)用。這些技術(shù)簡(jiǎn)化樣品預(yù)處理過(guò)程,甚至不需要預(yù)處理就可以分析蛋白凝聚凝膠的動(dòng)力學(xué),用于發(fā)現(xiàn)不同加工條件對(duì)于形成的凝膠特性的影響。但是現(xiàn)在依然不能直接用于真實(shí)的復(fù)雜的食品體系,伴著隨儀器設(shè)備的發(fā)展,它們必將為人類(lèi)提供更多有關(guān)食品蛋白質(zhì)凝聚凝膠化的有用信息。

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Technological Progress of Protein Aggregation and Gelation Research

Lu Xin Cheng Yongqiang LiLite
(College of food science and nutritional engineering,China AgriculturalUniversity,Beijing 100083)

Protein aggregation and gelation have significant value in food science because of their effectson food texture,structure and quality.However,their mechanis ms are very complex,people need advanced technology to study them.In this paper,some technological progress in protein aggregation and gelation research,such as atomic force microscopy(AFM),confocal scanning lightmicroscopy(CSLM),and diffusingwave spectroscopy(DWS)are introduced.Compared with conventional research methods like dynmic rheometer and scanning electron microscopy(SEM),these methods have advantages of simplifying sample pretreatment and of possibity for in situ investigation.As samples are in native state,the new methods reflect protein aggregation and gellingmore insightful and real.Due to high resolution,the changes of protein in aggregation and gelation are visible.Therefore using these new methods can provide more important information on protein aggregation and gelation.

AFM,DWS,CSLM,protein gelation

TS201.2

A

9035-1003-0174(2010)01-0132-07

“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2006BAD27B09)

2009-01-18

蘆鑫,男,1981年出生,博士,大豆蛋白加工

李里特,男,1948年出生,教授,博士生導(dǎo)師,食品科學(xué)與工程