陳明華

（攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院畜牧水產(chǎn)研究所，四川 617061）

遺傳標(biāo)記包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記（morphological marker）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological marker）、生物化學(xué)標(biāo)記（biochemical marker）、免疫學(xué)標(biāo)記（immune genetic markers）和分子標(biāo)記（molecular marker）5種類型。自從19世紀(jì)中期，奧地利學(xué)者孟德爾首創(chuàng)了將形態(tài)學(xué)性狀作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用先例以來，遺傳標(biāo)記得到發(fā)展和豐富。形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記、免疫學(xué)標(biāo)記等一直被廣泛應(yīng)用，然而這些標(biāo)記僅是遺傳物質(zhì)的間接反映，都無法直接反映遺傳物質(zhì)的特征，且易受環(huán)境的影響，因此具有很大的局限性。DNA分子標(biāo)記直接反映DNA水平上的遺傳變異，能穩(wěn)定遺傳、信息量大、可靠性高、消除了環(huán)境影響，可以反映生物的群體和個體特征。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和分子遺傳學(xué)的迅速發(fā)展，分子克隆及DNA重組技術(shù)的日趨完善，DNA水平的遺傳標(biāo)記得到廣泛應(yīng)用。本文就生物化學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記在四川黑山羊中的應(yīng)用作一綜述。

1 生物化學(xué)標(biāo)記

生化遺傳標(biāo)記是隨著各種電泳技術(shù)的發(fā)展而興起的一種遺傳標(biāo)記，以動物體內(nèi)的某些生化性狀為遺傳標(biāo)記，如血型、血清蛋白及同工酶。蛋白電泳所檢測的主要是血漿和血細(xì)胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的變化，通過對一系列蛋白和同工酶的檢測，就可為動物品種內(nèi)的遺傳變異和品種間的親緣關(guān)系提供有用的信息。因蛋白電泳技術(shù)操作簡便、快速及檢測費(fèi)用相對較低，且多態(tài)性比形態(tài)學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞遺傳標(biāo)記豐富。已被廣泛應(yīng)用于物種起源與分類研究和動物育種中。

余雪梅等［1］檢測了建昌黑山羊血清白蛋白（AIb）、運(yùn)鐵蛋白（Tf）和酯酶（Es）3個基因座的多態(tài)性。結(jié)果表明，建昌黑山羊、臺灣本地山羊、西德有色山羊3個品種山羊遺傳距離均超過0.1，它們都是獨(dú)立的品種。江明鋒等［2］分析山谷型藏山羊、建昌黑山羊、安哥拉山羊乳中的 LDH、as-CN、β-CN、β-lg、SA 等基因座，結(jié)果表明，3個品種的 LDH、as-CN、β-CN、β-lg有多態(tài)，SA 無多態(tài)。其中乳LDH有A、B、C三種表型。As-CN有AA、AB、BB三種表型。β-CN和β-lg多為雜合的AB型，其它的電泳表型極少。乳SA為單態(tài)，定為AA型。王杰等［3］采用PAGE法檢測安哥拉山羊改良建昌黑山羊雜交后代F3的 Hb、Tf、Hp、Pr、Alb、Po、LDH、Akp 和 Amy 等基因座的多態(tài)性，結(jié)果表明，F(xiàn)3的 Hb、Tf、Hp、Akp 呈多態(tài)，Alb、Pr、Po、LDH、Amy呈單態(tài)；LDH 同工酶相對活力順序為LDH1＞LDH3＞LDH2 ＞LDH4＞LDH5；F3與安哥拉山羊Akp基因型分布差異顯著（P＜0.05），與建昌黑山羊差異極顯著（P＜0.01）；LDH1的相對活力與凈毛率呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），LDH5與兩型毛根數(shù)百分比呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）、與兩型毛重量百分比呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）、與無髓毛伸度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），LDH其他各條帶的相對活力與產(chǎn)毛性狀無顯著相關(guān)。湯守富等［4］研究了金堂黑山羊血液運(yùn)鐵蛋白（Tf）、后白蛋白（Pa）及白蛋白（Alb）3個基因座的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明：金堂黑山羊群體中Tf和Pa兩個基因座均表現(xiàn)出多態(tài)性，Alb基因座呈單態(tài)；Tf和Pa兩個基因座基因型分布均符合Hardy-Weinberg定律。潘愛鑾等［5］研究了安哥拉山羊和建昌黑山羊及其高代雜種羊（F3）9個血液蛋白基因座的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明：建昌黑山羊血液 Alb、Pr、Pa、Tf、Hp、Hb、LDH、Amy 呈單態(tài)，Akp 呈多態(tài)。建昌黑山羊的平均基因雜合度與一致度分別為0.062 1和0.937 9。彭先文等［6］研究了建昌黑山羊等5個品種山羊及其部分雜一代的乳MUC1生化遺傳特性。結(jié)果表明：山羊乳MUC1呈現(xiàn)出多態(tài)性，基因型與山羊品種有關(guān)，建昌黑山羊有3種基因型，基因雜合度為0.495 0。鄭玉才等［7］研究了金堂黑山羊、巴普山羊等四川5個地方山羊品種及波爾山羊乳上皮黏蛋白MUC1的遺傳多態(tài)性。結(jié)果顯示，山羊乳MUC1表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性；MUC1的等位基因、基因型及其分布存在品種間差異；山羊乳MUC1基因雜合度較大，遺傳變異程度高；根據(jù)乳MUC1等位基因頻率對6個山羊品種進(jìn)行了聚類分析，能較好地反映各品種間的親緣關(guān)系。王杰等［8］分析成都麻羊和四川9個黑山羊品種（群體）酪蛋白多態(tài)性。結(jié)果表明，在供試山羊品種（群體）中β-CN呈單態(tài)，帶型為 β-CN （AB）；α-CN 均呈現(xiàn) αs1-CN（H）、αs1-CN（L）、αs2-CN（CC）和 αs2-CN（CD）型，在建昌黑山羊和白玉黑山羊中，還存在αs2-CN（DD）型。在建昌黑山羊和白玉黑山羊中，αs2-CN（CC）和 αs2-CN（CD）的乳脂含量顯著高于αs2-CN（DD）的乳脂含量（P＜0.05）。

2 分子標(biāo)記

由于分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，重組技術(shù)DNA的完善及PCR技術(shù)和新電泳技術(shù)的出現(xiàn)，涌現(xiàn)出了大量的分子遺傳標(biāo)記。與其他幾種遺傳標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速等優(yōu)越性。DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。

2.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD），擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的多態(tài)性。這種多態(tài)性具有個體特異性，與RFLP等其他分子標(biāo)記相比，RAPD具有DNA用量少、不需特殊的探針、靈敏度高、操作簡便、經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動植物遺傳作圖、基因快速定位、特殊染色體片段的鑒定和分離、性別鑒定以及群體遺傳變異的檢測。

鐘紅梅等［9］采用RAPD方法對藏山羊、安哥拉山羊、建昌黑山羊的巴普類群3個山羊品種（類群）的基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性和親緣關(guān)系研究，結(jié)果表明：3個山羊品種（類群）間的多態(tài)性大于品種（類群）內(nèi)的多態(tài)性，藏山羊與安哥拉山羊之間親緣關(guān)系較近，巴普類群與安哥拉山羊之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。王杰等［10］對四川9個黑山羊品種（群體）進(jìn)行RAPD標(biāo)記研究。結(jié)果表明，引物OPQ-06未在樂至黑山羊中擴(kuò)增出900 bp DNA片段，而在其他8個黑山羊品種（群體）中出現(xiàn)率均為1，可作為區(qū)分樂至黑山羊和其他8個黑山羊品種（群體）的分子遺傳標(biāo)記。引物OPK-03未在江安黑山羊擴(kuò)增出550bp DNA片段，在其他8個黑山羊品種（群體）中出現(xiàn)率均為1，可用于區(qū)分江安黑山羊和其他8個黑山羊品種（群體）的分子遺傳標(biāo)記。李力等［11］在黑山羊群體中共篩選到5個分子標(biāo)記分別與不同性狀相關(guān)，其遺傳基礎(chǔ)可能是該標(biāo)記與控制性狀的QTL或主基因連鎖。朱金秋等［12］對四川黑山羊、南江黃羊、北川白山羊、成都麻羊4個山羊品種和藏綿羊進(jìn)行RAPD分析。結(jié)果表明：黑山羊與南江黃羊的遺傳距離最小，親緣關(guān)系較近。

2.2 DNA指紋

以克隆或人工合成的探針進(jìn)行RFLP分析，可同時檢測到許多高變區(qū)，產(chǎn)生相應(yīng)譜帶，DNA指紋（DNA fingerprinting）圖具有高度變異性、個體專一性和組織穩(wěn)定性，是一項非常有價值的技術(shù)。另外，以微衛(wèi)星為基礎(chǔ)的寡核苷酸DNA指紋技術(shù)近年來也倍受研究者歡迎。DNA指紋技術(shù)可用于群體親緣關(guān)系、雜種優(yōu)勢預(yù)測、基因定位、標(biāo)記輔助選擇等方面。

晏兆莉［13］以人工合成的寡核苷酸（CAC）5/（GTG）5為探針，HaeⅢ酶切，采用地高辛（digitoxin）標(biāo)記及檢測技術(shù)，構(gòu)建山谷型藏山羊、安哥拉山羊及其雜種羊的DNA指紋圖譜。分析表明，山谷型藏山羊群體內(nèi)遺傳差異大，而安哥拉山羊遺傳差異小，雜種羊群體內(nèi)遺傳差異小于其母本山谷型藏山羊。在供試群體內(nèi)，兩個無關(guān)個體具有相同 DNA 指紋的概率為 1.1×10－5～1.9×10－11，系本譜帶遺傳給后代的概率符合0.5的預(yù)期值。王杰等［14］應(yīng)用寡苷酸探針（CA/GATA/TCC）5檢測安哥拉山羊和安哥拉山羊級進(jìn)雜交F2、F3的DNA指紋圖譜。結(jié)果表明，供試羊只個體平均檢出18.2±0.4條譜帶；在安哥拉山羊及其 F2、F3中，探針的鑒別機(jī)率分別為 1.38×10-12、1.18×10-13、0.50×10-10；群體內(nèi)DNA指紋平均相似系數(shù)安哥拉山羊及其F2、F3分別為0.453 9、0.407 7和 0.611 1；在安哥拉山羊DNA指紋圖譜中，發(fā)現(xiàn)2.3kb和8.6kb譜帶為特異性譜帶。王杰等［15］研究安哥拉山羊和建昌黑山羊及安哥拉山羊與建昌黑山羊級進(jìn)雜交的F2、F3的DNA指紋圖譜。結(jié)果表明，安哥拉山羊、F2、F3的鑒別機(jī)率分別為 1.38×10-12、1.18×10-13、0.50×10-10；親子鑒定的父權(quán)概率W=0.988 9。王杰等［16］研究四川9個黑山羊品種（群體）的DNA指紋圖譜，結(jié)果表明，在供試黑山羊中，未發(fā)現(xiàn)有共同的譜帶和性別特異譜帶。9.0 kb和2.2 kb為建昌黑山羊共有譜帶，9.0 kb為金堂黑山羊共有譜帶，9.0kb、6.2kb和5.5 kb為白玉黑山羊共有譜帶，其余各黑山羊品種（群體）內(nèi)無共有譜帶。

2.3 隨機(jī)片段長度多態(tài)

隨機(jī)片段長度多態(tài)AFLP（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術(shù)結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。重復(fù)性強(qiáng)、可信度高、多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高，不需要Southern雜交，無放射性危害，且不需要預(yù)先知道被分析基因組DNA的序列信息，樣品適用性廣、遺傳性穩(wěn)定，在遺傳育種研究、基因組研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。

王杰等［17］采用AFLP標(biāo)記研究成都麻羊與8個黑山羊品種（群體）的遺傳多樣性。結(jié)果表明，供試8個山羊品種（群體）的遺傳多樣性指數(shù)在0.088 8～0.228 9之間，其中營山黑山羊的遺傳多樣性指數(shù)最大，白玉黑山羊最小，其余山羊品種（群體）介于其間。

2.4 微衛(wèi)星DNA

微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復(fù)序列，微衛(wèi)星DNA數(shù)量多且均勻分布在基因組中，具有豐富的多態(tài)性，并且微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測可以顯示純合子和雜合子。微衛(wèi)星檢測容易、重復(fù)性較好、省時，適合于進(jìn)行自動化分析等優(yōu)點(diǎn)。已廣泛用于構(gòu)建物種的遺傳連鎖圖譜、基因鑒定、物種演化和群體間遺傳分化研究等。

王杰等［18］對四川9個黑山羊品種（群體）進(jìn)行微衛(wèi)星DNA遺傳多態(tài)性研究，結(jié)果表明，10個微衛(wèi)星座位在9個黑山羊品種（群體）中均為高度多態(tài)座位。嘉陵與營山黑山羊聚為一類；自貢與江安黑山羊聚在一起后，再與合江黑山羊聚為一類；金堂與樂至黑山羊聚為一類；白玉與建昌黑山羊聚為一類。最后4種聚為一大類。陳明華等［19］對四川9個黑山羊品種（群體）進(jìn)行X染色體微衛(wèi)星DNA遺傳多態(tài)性研究，結(jié)果表明，7個微衛(wèi)星座位在9個黑山羊品種（群體）中均為高度多態(tài)座位，聚類結(jié)果與王杰等（2006）的結(jié)果一致。

2.5 線粒體DNA

造成線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）多態(tài)性的原因主要是堿基取代、長度變化和序列重排，因而可以利用限制性酶切技術(shù)直接檢測mtDNA的多態(tài)性。mtDNA以其分子量小、進(jìn)化速度快（為單拷貝基因的5～10倍）、遺傳上具有自主性和嚴(yán)格的母系遺傳等特性而被廣泛應(yīng)用于分子進(jìn)化、親緣關(guān)系、畜群遺傳結(jié)構(gòu)、雜種優(yōu)勢預(yù)測和地方品種資源考察。

李祥龍等［20］研究了建昌黑山羊等來自國內(nèi)18個地方山羊品種mtDNA的RFLP，研究結(jié)果提示我國地方山羊品種起源于兩種不同的母系祖先；我國地方山羊品種mtDNA遺傳多樣性比較貧乏，分化程度較低。王杰等［21］對成都麻羊與四川各地黑山羊品種（群體）mtDNA D-1oop序列多態(tài)性進(jìn)行分析。共檢測到l0種單倍型，群體間共有多態(tài)座位83個，單一多態(tài)座位23個，簡約信息座位24個，平均核苷酸歧異度為0.001 510，D-loop序列多態(tài)性較貧乏。10個品種（群體）分為兩大類，合江黑山羊與江安黑山羊先聚在一起后，再與自貢黑山羊聚為一類，營山黑山羊與嘉陵黑山羊聚為一類，兩類形成一大類；成都麻羊先與金堂黑山羊聚在一起后，再依次與樂至黑山羊、建昌黑山羊、白玉黑山羊形成另一大類，最后兩個大類聚在一起。聚類結(jié)果與品種（群體）來源和生態(tài)地理分布相一致。

3 展望

四川省的黑山羊資源十分豐富，約有1 300萬只，遍布全省絕大部分地區(qū)。主要有建昌黑山羊、金堂黑山羊、樂至黑山羊、自貢黑山羊、合江黑山羊、江安黑山羊、白玉黑山羊、營山黑山羊、嘉陵黑山羊、美姑黑山羊等。近年來，為了促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展，先后命名了金堂黑山羊、樂至黑山羊、自貢黑山羊等地方品種。

除了從形態(tài)特征和生產(chǎn)性能鑒別分布在不同地區(qū)的黑山羊品種（群體）間的差異外，由于歷史和地域等原因，各個品種（群體）間的遺傳關(guān)系不是很清楚。雖然一些研究者［10，16-19，21］從分子水平研究這些黑山羊品種（群體）的遺傳多樣性，但是，為了對四川黑山羊品種（群體）進(jìn)一步選育提高以及品種資源的合理保護(hù)和開發(fā)利用還需要更系統(tǒng)、更全面地從分子水平研究這些黑山羊品種（群體）的遺傳多樣性，了解這些黑山羊品種（群體）的進(jìn)化歷史、分類地位和相互關(guān)系，從分子水平界定其是品種、不同生態(tài)類型還是雜交群體。

由于具有其他標(biāo)記無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，分子遺傳標(biāo)記在四川黑山羊群體遺傳變異研究、基因定位研究、群體親緣關(guān)系以及標(biāo)記輔助選擇研究等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

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