楊 琳，楊曉燕，李云霞，蘇鴻雁

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

新鮮鹿糞便中捕食線蟲真菌的分離和鑒定

楊 琳，楊曉燕，李云霞，蘇鴻雁*

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

從100份新鮮鹿糞樣中分離到4種捕食線蟲真菌，通過對(duì)其孢子著生方式、孢子形狀、捕食器官等形態(tài)學(xué)觀察，鑒定為節(jié)叢孢屬（Arthrobotrys）的少孢節(jié)叢孢（A.oligospora）和彎孢節(jié)叢孢（A.musiformis），單頂孢屬（Monacrosporium）的橢圓單頂孢（M.ellipososporum）和白色單頂孢（M.candidum）。

捕食線蟲真菌；分離；鑒定；鹿糞

家畜寄生線蟲可對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的損失，對(duì)病原線蟲的生物防治一直被認(rèn)為是安全、有效的措施之一。家畜寄生線蟲種類繁多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在青海危害反芻家畜的線蟲種類達(dá)85種，其中肺線蟲13種，消化道線蟲71種，橫紋肌寄生線蟲1種，經(jīng)濟(jì)損失十分嚴(yán)重〔1〕。單是侵染青海省牦牛的寄生線蟲就有乳突類圓線蟲（Strongyloides papillosus）、陜西夏柏特線蟲（Chabertia Shanxiensis）、和田古柏線蟲（Cooperia hetianensis）、羊夏伯特線蟲（Chabertia ovina）、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）、粗紋食道口線蟲（Oesophagostomum.asperum）等40余種〔1〕。

多年來，對(duì)家畜線蟲病的防治主要以化學(xué)藥物防治和合理的放牧管理為主。化學(xué)藥物進(jìn)行防治副作用較大，寄生線蟲對(duì)化學(xué)驅(qū)蟲劑抗藥性的日益顯現(xiàn)，已經(jīng)成為防治中需要解決的關(guān)鍵問題〔2〕；藥物殘留以及藥物代謝產(chǎn)物對(duì)生態(tài)環(huán)境有嚴(yán)重的負(fù)面影響，而且多數(shù)化學(xué)藥物僅對(duì)成蟲起作用，對(duì)蟲卵及幼蟲無能為力。目前，在研發(fā)新型化學(xué)驅(qū)蟲劑的同時(shí)，尋找其它替代防治方法日益受到重視，其中，生物防治（簡稱生防）被認(rèn)為是最有效和環(huán)保的措施之一。

在自然界中廣泛分布有一類被稱為捕食線蟲真菌（nematode-trapping fungi）的線蟲天敵，其可以通過菌絲特化形成各種捕食結(jié)構(gòu)（捕食器，traping device）捕食線蟲，是目前研發(fā)寄生線蟲生防制劑的重要資源〔3〕。利用捕食線蟲真菌對(duì)線蟲感染進(jìn)行控制是一種高新生物防治技術(shù)，利用線蟲天敵進(jìn)行生物防治具有無污染、無殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。其特點(diǎn)是對(duì)線蟲的幼蟲起作用，在其感染動(dòng)物之前就將其殺死，避免了家畜的感染或重復(fù)感染〔4〕。在一些畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國家如新西蘭，澳大利亞等，利用食線蟲真菌防治動(dòng)物寄生線蟲病取得了一定進(jìn)展〔5-7〕。其中，捕食線蟲真菌（Athrobotrys flagrans）已被開發(fā)成生防制劑，在新西蘭〔8〕、瑞典〔9〕、美國〔10〕等國家成功用于防治家畜寄生線蟲。該菌能產(chǎn)生大量厚垣孢子，經(jīng)動(dòng)物腸道消化后能成活并捕食糞便中的線蟲。給牧羊、牛服用食線蟲真菌一段時(shí)間后，牧場土壤中感染性幼蟲數(shù)量顯著降低，從而使放牧家畜的胃腸道寄生蟲數(shù)量和糞便中蟲卵數(shù)減少，臟器病變減輕，增重獲得較大改善，達(dá)到了生物防治線蟲的目的〔11〕。這些研究和實(shí)際應(yīng)用的現(xiàn)狀給我們展示了利用捕食線蟲真菌防治家畜寄生線蟲的巨大潛力。

在家畜寄生線蟲生物防治中，生防菌株既要有較強(qiáng)的浸染力，還需具有較強(qiáng)的抗腸道消化能力。糞便中的捕食線蟲真菌以糞便為營養(yǎng)基質(zhì)在牧場中生存繁衍，很多種類伴隨動(dòng)物的取食而進(jìn)入腸道，又隨糞便排出。因此，從家畜自然糞便中分離的捕食線蟲真菌常常具有很強(qiáng)的抗消化特性〔12〕。對(duì)特定牧區(qū)寄生線蟲的生物防治，土著生防菌因長期適合本地區(qū)自然環(huán)境條件而成為首選的評(píng)估資源〔4〕，對(duì)青藏高原等特殊生境牧區(qū)選育適合本地區(qū)的生防菌株尤為重要。

生防資源是生物防治的基礎(chǔ)，掌握家畜鮮糞便中捕食線蟲真菌的生態(tài)分布規(guī)律，鑒定和保存大量的菌株資源，研究生防真菌對(duì)線蟲的侵染機(jī)理，評(píng)估捕食線蟲真菌捕食能力及抗消化能力對(duì)于生防制劑的開發(fā)和應(yīng)用非常關(guān)鍵。因此，調(diào)查這類生物資源在動(dòng)物糞便中的分布情況，是生物防治家畜寄生性線蟲病的基礎(chǔ)和前提條件〔6，13－14〕。本研究主要是對(duì)鹿糞中的捕食線蟲真菌進(jìn)行調(diào)查，研究結(jié)果將極大地豐富動(dòng)物寄生蟲生防資源，為家畜寄生蟲防治提供理論基礎(chǔ)和物質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 鹿糞樣 共100份，采自大理州永平縣鹿養(yǎng)殖場。樣品采集方法：采樣時(shí)為避免污染，最好是在糞便落地前收集（但如果是已落地的糞便，必須除去表層）。用采樣勺采集40g左右的糞便樣品裝入無菌的塑料封口袋。在自然條件下，2周內(nèi)處理完所采回的糞便樣品。否則，應(yīng)放入4℃冰箱內(nèi)。

1.2 誘餌線蟲 誘餌線蟲的培養(yǎng)：向燕麥片培養(yǎng)基（燕麥片50g裝入250mL三角瓶中，加入60%的水，靜置30min，使燕麥片充分濕潤，121℃滅菌20～30min）接種線蟲（Panagrellus redivivus），28℃培養(yǎng)1周左右，觀察到三角瓶瓶壁上有線蟲爬壁時(shí)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

誘餌線蟲的制備：取少許上述培養(yǎng)物于二層擦鏡紙上置于漏斗（漏斗通過軟管與收集管相接），加適量無菌水，擠壓軟管排除氣泡，靜置一定時(shí)間，直至濾出物達(dá)到需要量，取收集管中的濾出物，離心水洗三次，加無菌水至線蟲濃度約為（2～3）×104條/mL。

1.3 培養(yǎng)基 玉米粉培養(yǎng)基（CMA）：玉米粉30g，瓊脂16g，水1 000mL，自然pH值。玉米粉加水適量煮沸30min，四層紗布過濾，濾液加水至1 000mL，混勻，分裝。121℃滅菌20～30min。主要用于捕捕食線蟲真菌的分離、鑒定。

1.4 分離方法 誘餌平板法：用滅菌牙簽將約2～3g樣品挑到CMA平板上，加入線蟲約5 000條做誘餌，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。室溫培養(yǎng)3～4周后，在解剖鏡10～40倍下，對(duì)每個(gè)平板鏡檢。觀察到捕食線蟲真菌，用無菌牙簽挑取其單個(gè)孢子，在酒精燈下迅速轉(zhuǎn)接到60mmCMA平板上，并用此牙簽在接入孢子地方的附近切掉一小塊約0.5cm×1cm的培養(yǎng)基，形成以后用于觀察捕食器的小觀察室，然后置于25℃培養(yǎng)箱中或室溫培養(yǎng)。

1.5 鑒定方法 利用立體解剖鏡對(duì)已產(chǎn)生孢子和捕食器官的真菌進(jìn)行鑒定；對(duì)未產(chǎn)生捕食器官的真菌，則挑單孢子于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，再轉(zhuǎn)于低營養(yǎng)的CMA培養(yǎng)基上，用高仁恒等〔15〕及蘇鴻雁等〔16〕的方法誘導(dǎo)捕食器官產(chǎn)生，然后進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

分離培養(yǎng)結(jié)果：共分離到4種捕食線蟲真菌，通過對(duì)其著生方式、孢子、捕食器官等的形態(tài)學(xué)觀察、測定，分別為節(jié)叢孢屬（Arthrobotrys）的少孢節(jié)叢孢菌（A.oligospora）和彎胞節(jié)叢孢菌（A.musiformis），單頂孢屬（Monacrosporium）的橢圓單頂孢（M.ellipososporum）和白色單頂孢（M.candidum）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從鹿的新鮮糞便中分離出了4種捕食線蟲真菌，其中A.oligospora的分出率為10%；A.musiformis的分出率為8%，M.ellipsosporum的分出率為7%，M.candidum的分出率為2%。此次糞便中捕食線蟲真菌的檢出率和種類與秦澤榮等〔17〕所作的新鮮牛糞中的相似，但比在土樣及陳糞〔18〕中都少，原因是所采樣鹿糞糞樣單一，只是一個(gè)養(yǎng)殖場的，飼料單一，干草成分多，青飼料少，再加上由于動(dòng)物消化道的消化作用和酸、堿、熱等環(huán)境，隨食物吃進(jìn)去的捕食線蟲真菌能抵御消化道惡劣環(huán)境并出現(xiàn)在糞便中的頻率不高，同時(shí)新鮮糞便未接觸土壤，減少了外界污染的概率。本研究直接從動(dòng)物的新鮮糞便中分離出的捕食線蟲真菌，理論上講應(yīng)具有抗消化能力，與從土壤中分離的捕食線蟲真菌菌株相比，更有可能用于動(dòng)物線蟲病的生防，但需進(jìn)一步進(jìn)行生防效果實(shí)驗(yàn)。

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Isolation and Identification of Nematophagous Fungi from Free Faeces of Deer

YANG Lin,YANG Xiaoyan,LIYunxia,SU Hongyan*
（College of Agriculture and Bioscience,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671003，China）

Four strains of nematophagous fungi belonging to Arthrobotrys and Monacrosporium were isolated from fresh faeces of deer in the present study.The fungiwere,respectively,identified as A.oligospora.A.musiformis,M.ellipososporum and M.candidum.. Themorphological features of the isolated fungiwere described in detail.

nematophagous fungi；isolation；identification；faeces of deer

Q938.1

A

1672-2345（2010）10-0040-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31060019）

2010-09-19

楊琳，講師，主要從事微生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究.

*通信作者：蘇鴻雁，教授，E-mail：suhongyan16@yahoo.com.cn

（責(zé)任編輯 李 明）