李業(yè)成，馬鳳鳴，吳 蕾，劉 成，王安娜，王嬋嬋

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐表明，非禾谷作物連作，將會出現(xiàn)發(fā)育不良，病蟲害嚴(yán)重，以致于嚴(yán)重減產(chǎn)。因此,非禾谷類作物連作障礙已是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上亟待解決的一大難題[1]。連作障礙（Continuous cropping obstacles）是作物栽培中的一種普遍存在的問題。黑龍江省作為我國大豆主產(chǎn)區(qū)，大豆種植面積廣，連作問題嚴(yán)重[2-4]。探討連作導(dǎo)致大豆減產(chǎn)的因素及解決連作帶來的生產(chǎn)障礙問題已成為國內(nèi)外研究關(guān)注的焦點。根系分泌物是植物在生長過程中通過根的不同部位向基質(zhì)（土壤、營養(yǎng)液等）中溢泌或分泌的一組種類繁多的物質(zhì)。閻吉昌指出，在連作大豆體系的研究中存在很多不足之處[5]，例如對化感物質(zhì)作用的選擇性和專一性、對同一植物化感物質(zhì)高濃度和低濃度時作用產(chǎn)生的差異化感物質(zhì)多種成分之間產(chǎn)生的復(fù)合效應(yīng)等。根系分泌物主要包括下列幾種類型：滲出物、分泌物、粘膠質(zhì)、脫落物[6]。為了進(jìn)一步研究大豆根分泌物在大豆連作障礙中的化感作用，本文設(shè)置正茬土、連作兩年土培養(yǎng)大豆，待15 d后，以二氯甲烷作為溶劑，提取大豆根系分泌物，對大豆種子萌發(fā)和胚根生長進(jìn)行測試。并采用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析法分別對正茬、連作大豆幼苗根系分泌物的二氯甲烷提取物進(jìn)行鑒定，進(jìn)而分析提取物的成份差異，為進(jìn)一步研究連作大豆根系分泌物的化感作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用大豆品種抗線4號。大豆正茬土、連作兩年土均取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊農(nóng)場。

1.2 根系分泌物的提取

1.2.1 幼苗土培

選擇大小均勻、飽滿的大豆種子，用蒸餾水浮選去掉癟粒，然后用30%的H2O2進(jìn)行消毒，分別選取20粒大豆種子，播種在裝有正茬土、連作兩年土的桶中（底部和側(cè)面均打孔）。桶的規(guī)格為直徑30 cm，高度40 cm。將桶置于光線良好的室外，注意桶中土的濕度，保持土為半濕潤狀態(tài)，并及時補充蒸餾水。

1.2.2 根系分泌物的收集

將培養(yǎng)了15 d的大豆幼苗，從桶中小心地將幼苗取出，用蒸餾水沖洗根部的泥土，沖洗3遍，最后用無菌水沖洗3遍，去除根表面吸附的離子以及根系分泌的其他物質(zhì)。不要傷及根系，保證根系完整。將幼苗移至到6 L 0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液中，在室內(nèi)光線良好的條件下培養(yǎng)4 h（10：00～14：00）后，用500 mL二氯甲烷溶液提取根洗液3次，將提取液用濾紙過濾后，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40～45℃條件下濃縮至50 mL，再將提取液用0.45 μm濾膜過濾后，轉(zhuǎn)移到儲藏瓶中，保存在4℃低溫冰箱中備用。

在本文里，用正茬土栽培條件下收集到的大豆根系分泌物稱為正茬大豆分泌物，在連作兩年土栽培條件下收集到的大豆根系分泌物稱為連作大豆根系分泌物。

1.2.3 根系分泌物的分離鑒定

運用氣質(zhì)聯(lián)用儀（島津GC/MS-QP2010）檢測大豆根系分泌物成分。采用電子轟擊源，轟擊電壓70 eV，掃描范圍M/Z30-500，掃描速度0.4 s掃全程。毛細(xì)管柱：SE-54（30 m×0.32 mm×0.25 μm），離子源溫度200℃，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫50℃，以10℃·min-1程序升溫至250℃。載氣為He，流量為1 mL·min-1，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。溶劑延遲時間3.0 min。人工分析并與NIST05譜庫核對，確定各組分物質(zhì)結(jié)構(gòu)及名稱。

1.2.4 生物檢測

在直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，鋪三張定性濾紙（試驗所用濾紙、培養(yǎng)皿等器具使用前均高壓蒸汽滅菌（0.14 MPa，121℃ 20 min），分別加入正茬、連作大豆根系分泌物的提取液（RE）10.0 mL，（每皿含1株植株4 h的根系分泌物為1倍，含2株植株4 h的根系分泌物為2倍，含1株植株4 h的根系分泌物1倍稀釋液為1/2倍），對照（CK）加入二氯甲烷試劑10.0 mL，各處理待溶劑揮發(fā)干后，加入蒸餾水10.0 mL，再將30粒經(jīng)消毒稍膨脹（20 min）均勻一致的種子放到濾紙上，蓋上蓋，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天加入1.0 mL H2O，保持濾紙為濕潤狀態(tài)。每天上午9：00記錄種子萌發(fā)情況（以芽長超過種子長度計為發(fā)芽，發(fā)芽率為規(guī)定發(fā)芽時間結(jié)束時統(tǒng)計的各組發(fā)芽數(shù)與試驗的種子數(shù)之間的比值），連續(xù)記錄3 d。3 d后向培養(yǎng)皿中加入經(jīng)鹽酸消毒的石英砂100 g，補加不同濃度的兩種試液5.0 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每4 d補加一次蒸餾水5.0 mL。12 d后分別選取長勢一致健康的大豆幼苗5株，進(jìn)行初生根長度的測定。

化感作用抑制率（Inhibitory rate,IR）的測定參照文獻(xiàn)[7]，IR（%）=（Ti-T0）/T0×100%，IR 絕對值的大小代表累加化感作用強(qiáng)度。式中，Ti為處理值，T0為對照值，當(dāng)IR≥0時，表示促進(jìn)作用，當(dāng)IR＜0時，表示抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆根系分泌物GC-MS鑒定結(jié)果

對正茬、連作大豆根系分泌物的二氯甲烷提取液進(jìn)行GC-MS鑒定，結(jié)果表明（見表1、2），兩種分泌物都檢測出醇、酸、烴、酯、酚、苯、酰胺、萘、醛、酮類物質(zhì)以及其他烴類衍生物。不同的是其中組分有較大差異。將兩種條件下的根系分泌提取物成分進(jìn)行比較，其中相同的成分有乙苯、鄰二甲苯、苯乙烯、丙三醇、十二烷、苯丙噻唑、十四烷、5-甲基-十四烷、十六烷、二十四烷、十七烷、2，6，10-三甲基-十五烷、鄰苯二甲酸二異丁酯等。連作大豆根系分泌物提取物中，（E）-2-丁烯酸、7，9-二甲基-十六烷、甲基-丁二酸、2-乙基-1-十二醇、二十烷、十一醛相對含量較高，而這些物質(zhì)在正茬大豆分泌中未被檢測到。這些物質(zhì)在大豆連作中的化感作用有待進(jìn)一步研究。

表1 正茬大豆根系分泌物GC-MS鑒定Table 1 Assay results of root secretion of soybean rotation by GC-MS

表2 連作大豆根系分泌物GC-MS鑒定Table 2 Assay results of root secretion of continuous soybean by GC-MS

續(xù) 表

2.2 大豆根系分泌物對大豆種子萌發(fā)和初生根生長的影響

最常用檢測化感作用活性的方法是測定種子萌發(fā)率和初生根的生長情況。大豆根系分泌物的二氯甲烷提取液對大豆種子萌發(fā)和初生根的生長有很大影響。由表3、4可知，正茬、連作大豆根系分泌物對大豆種子萌發(fā)和初生根生長都表現(xiàn)出抑制作用，并隨濃度增大抑制作用增強(qiáng)。與對照相比，正茬大豆根系分泌物1倍、2倍濃度處理對大豆種子萌發(fā)率表現(xiàn)出極顯著的抑制作用，且處理間差異顯著。1/2倍濃度處理對大豆初生根生長抑制作用不顯著，1倍、2倍濃度處理對大豆初生根生長能達(dá)到顯著抑制作用水平，其化感抑制率分別為18%、36.2%；連作大豆根系分泌物不同濃度處理對大豆種子萌發(fā)都表現(xiàn)出極顯著抑制作用水平，且各處理間差異顯著。1倍、2倍濃度處理對大豆初生根生長能達(dá)到極顯著抑制作用水平，其化感抑制率分別為37.1%、52.6%。

表3 正茬大豆根分泌物對大豆種子萌發(fā)和初生根生長的影響Table 3 Effect of root secretion of soybean rotation on seeds germination and primary root growth

表4 連作大豆根分泌物對大豆種子萌發(fā)和初生根生長的影響Table 4 Effect of root secretion of continuous soybean on seeds germination and primary root growth

無論是正茬還是連作大豆根系分泌物對大豆種子的萌發(fā)和初生根生長都表現(xiàn)出抑制作用，抑制作用隨濃度的增大而增大。在相同濃度處理下，連作大豆根系分泌物對種子萌發(fā)和胚根生長的化感作用要高于正茬。

3 討論與結(jié)論

根系分泌物是傳遞化感效應(yīng)的主要物質(zhì)，次生代謝產(chǎn)生的根系分泌物中有很大一部分具有自毒作用，植物的生長環(huán)境發(fā)生改變或者處于逆境條件下，根系的分泌活動也會發(fā)生相應(yīng)的變化。

本試驗采用土培盆栽的方法，收集正茬土、連作土的大豆根系分泌物，并以二氯甲烷作為溶劑提取大豆根系分泌物，分別設(shè)置不同濃度處理對供試植物進(jìn)行生物檢測，結(jié)果表明，大豆苗期根分泌物產(chǎn)生的化感物質(zhì)對“下茬”大豆幼苗的生長和某些生理活性均有顯著影響。無論是正茬還是連作大豆根系分泌物對大豆種子的萌發(fā)和胚根生長都表現(xiàn)出抑制作用，并且隨濃度的增大抑制作用而增強(qiáng)。在相同濃度處理下，連作大豆根系分泌物對種子萌發(fā)和胚根生長的化感作用要高于正茬。這與連作條件下分泌更多的化感物質(zhì)作用有關(guān)。大豆連作種植條件下，根系分泌的物質(zhì)的種類和數(shù)量都顯著增加。

植物次生代謝產(chǎn)生的根分泌物主要用來適應(yīng)不良環(huán)境，且根分泌物中包含很多化感物質(zhì)，大豆苗期根系分泌物的二氯甲烷提取物有醇、酸、烴、酯、酚、苯、酰胺、萘、醛、酮類物質(zhì)以及其他類衍生物等。本試驗鑒定大豆根系分泌物并分析其成分，相同的成分有乙苯、鄰二甲苯、苯乙烯、丙三醇、十二烷、苯丙噻唑、十四烷、5-甲基-十四烷、十六烷、二十四烷、十七烷、2,6,10-三甲基-十五烷、鄰苯二甲酸二異丁酯等。連作大豆根系分泌物提取物中，（E）-2-丁烯酸、7,9-二甲基-十六烷、甲基-丁二酸、2-乙基-1-十二醇、二十烷、十一醛相對含量較高，而這些物質(zhì)在正茬大豆分泌物中沒有被檢測到。連作大豆根系分泌的物質(zhì)種類復(fù)雜，數(shù)量和性質(zhì)上也有很大差異，利用有機(jī)溶劑提取的也只是其中的一部分，而且這些物質(zhì)很可能具有化感作用，這些物質(zhì)在大豆連作中的化感作用還需進(jìn)一步研究。

[1]吳鳳芝,趙風(fēng)艷.根系分泌物與連作障礙[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,34(1)∶114-118.

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[3]張重義,林文雄.藥用植物的化感自毒作用于連作障礙[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報,2009,17(1)∶189-196.

[4]張小玲,潘振剛,周曉雄,等.自毒作用與連作障礙[J].土壤學(xué)報,2007,38(4)∶781-784.

[5]閻吉昌.連作大豆化感作用研究[J].大豆科學(xué),2002(3)∶214-217.

[6]吳鳳芝,趙風(fēng)艷,劉元英.設(shè)施蔬菜連作障礙原因綜合分析與防治措施[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000,31(3)∶241-247.

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