趙 欣，盧翠華，陳伊里，石 瑛，邸 宏，張麗莉，張正國，張 歡

（東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030）

馬鈴薯是同源四倍體植物，基因分離復雜，隱性基因的表現頻率低，建立在四倍體水平上的雜種實生苗和無性系選擇的常規(guī)育種方法效率比較低。此外，馬鈴薯普通栽培種基因庫比較狹窄，而具有豐富基因的大量野生種質資源約75%為二倍體，普通栽培種與其雜交受到倍性障礙而難以成功，限制了野生種質中優(yōu)良基因的利用。因此，開展馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究對于優(yōu)良品種的選育和改良具有重要意義。

我國從20世紀80年代開始進行馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究，但是一直存在誘導率低、白化苗、混倍現象等問題，因此，一直沒能在馬鈴薯育種中得到廣泛應用[1-3]。馬鈴薯花藥培養(yǎng)受基因型、激素配比、溫度和甘露醇處理等因素的影響[4-5]，培養(yǎng)基中添加的硝酸銀、活性炭、馬鈴薯提取液也是影響花藥培養(yǎng)的重要因素。

本試驗以馬鈴薯栽培種（Solanum tuberosum L.）為材料，對培養(yǎng)基添加物硝酸銀、活性炭、馬鈴薯提取液進行研究，以期建立高效穩(wěn)定的馬鈴薯花藥培養(yǎng)體系，為馬鈴薯新品種的選育提供有效的育種途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以Vangal、波C、訥16、春薯4號和內薯7號5個馬鈴薯品種（系）為材料，由大興安嶺地區(qū)農業(yè)科學研究所、黑龍江省農業(yè)科學院克山馬鈴薯研究所、東北農業(yè)大學馬鈴薯研究室、內蒙古呼盟農業(yè)科學研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 花蕾的采集及花粉發(fā)育時期的檢測

2008年7月，在馬鈴薯盛花期采集長度約5～6 mm的花蕾，取蕾時間8：00～9：00 am，撕開花瓣，取出花藥（花藥長度3～4 mm），用卡諾固定液固定，采用醋酸洋紅染色，在40倍顯微鏡下觀察花粉的發(fā)育階段，選取小孢子處于單核靠邊期花藥，接種在培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)基配方

誘導培養(yǎng)基：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-12，4-D+1.0 mg·L-1KT+6%蔗糖+0.7%瓊脂；分化培養(yǎng)基：MS+0.5 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂。

1.2.3 消毒與接種

將花蕾用自來水沖洗10～20 min，在超凈工作臺上，用70%的酒精滅菌30 s，0.1%的HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗3～4次，用鑷子取出花藥接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。接種密度為每100 mL三角瓶40個，每個處理5瓶。置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，待誘導出愈傷組織或胚狀體后，將其放于光下培養(yǎng)。光照 16 h·d-1，黑暗 8 h·d-1。

1.2.4 誘導培養(yǎng)基不同添加物的處理

1.2.4.1 硝酸銀處理

將內薯7號和Vangal接種在誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中分別添加10、20、30 mg·L-1的硝酸銀，以不加硝酸銀的為對照，30 d后統(tǒng)計褐化率及愈傷誘導率。

1.2.4.2 活性炭處理

將訥16和Vangal接種在誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中分別添加0.25、0.50、0.75 g·L-1的活性炭，以不加活性炭為對照，30 d后統(tǒng)計褐化率及愈傷誘導率。

1.2.4.3 馬鈴薯提取液處理

將訥16、春薯4號、內薯7號和波C接種在誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中添加馬鈴薯提取液50 g·L-1，以不添加馬鈴薯提取液為對照，30 d后統(tǒng)計愈傷誘導率。

1.2.4.4 統(tǒng)計方法

褐化率（%）=褐化的花藥數/接種的花藥數×100%

愈傷組織誘導率（%）=形成愈傷組織的花藥數/接種的花藥數×100%

1.2.5 分化培養(yǎng)基的篩選

選用內薯7號、訥16、波C和春薯4號的愈傷組織為試驗材料，轉入以下4種分化培養(yǎng)基。每個處理5瓶，置于光下培養(yǎng)，調查愈傷組織分化情況。

分化培養(yǎng)基如下：

A：MS+0.5 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂

B：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂

C：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂

D：MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1KT+3%蔗糖+0.7%瓊脂

1.2.6 再生植株根尖染色體倍性鑒定

再生植株在生根培養(yǎng)基（MS+0.5 mg·L-1NAA）中誘導生根，根長約1 cm時，7：00～8：00 am剪取根，洗去根上殘存的培養(yǎng)基，置于冰水混合物中預處理24 h，用固定液（95%乙醇：冰乙酸=3：1）固定24 h，取出根用蒸餾水沖洗3～4遍，用醋酸洋紅染色后制片，在100倍光學顯微鏡下觀察染色體數目。

2 結果與分析

2.1 硝酸銀對馬鈴薯花藥褐化及愈傷組織誘導的影響

培養(yǎng)基中加入適量的硝酸銀有助于減輕花藥的褐化程度。由表1可知，隨著硝酸銀濃度的增加，花藥的褐化率呈逐漸下降趨勢，各處理間差異顯著。內薯7號和Vangal的變化趨勢基本一致，硝酸銀濃度從10 mg·L-1增加到30 mg·L-1時，褐化率分別從77.5%和89.5%分別降到67%和71%，且均低于對照。

試驗材料內薯7號和Vangal，隨著硝酸銀濃度的增加，愈傷組織誘導率呈先升后降趨勢。當硝酸銀濃度為20 mg·L-1時愈傷組織誘導率達到最大值，分別為10.5%和8.0%，與10、30 mg·L-1及對照相比差異顯著。當硝酸銀濃度增加到30 mg·L-1時，愈傷組織誘導率分別降到7.0%和3.5%，仍高于對照，但差異不顯著。

表1 硝酸銀對花藥褐化率及愈傷組織誘導率的影響Table 1 Effect of silver nitrate on anther browning rate and callus induction rate

2.2 活性炭對馬鈴薯花藥褐化及愈傷組織誘導的影響

由表2可知，訥16和Vangal在加入活性炭的培養(yǎng)基中褐化率均顯著低于對照。隨著活性炭濃度的增加，花藥褐化率逐漸降低。其中訥16的褐化率從80%降到75%，Vangal從90%降到84%。

當活性炭濃度為0.50 g·L-1時，愈傷組織誘導率最高，訥16從原來的4.5%提高到11%，Vangal從原來的3.0%提高到8.0%，但當活性炭濃度增加到0.75g·L-1時，愈傷組織誘導率又分別降到7.5%和2.0%。Vangal的降幅較大，誘導率低于對照（見表 2）。

表2 活性炭對花藥褐化率及愈傷組織誘導率的影響Table 2 Effect of active carbon on anther browning rate and callus induction rate

2.3 馬鈴薯提取液對馬鈴薯花藥愈傷組織誘導的影響

由圖1可知，訥16、春薯4號、內薯7號、波C這4份材料的愈傷組織誘導率均高于對照。其中波C的增幅較大，從0.5%提高到2.5%，提取液對其他3份材料的促進作用也非常明顯。因此，培養(yǎng)基中加入適量的馬鈴薯提取液能促進愈傷組織的誘導。

2.4 不同培養(yǎng)基對花藥分化的影響

利用新復極差法，對各培養(yǎng)基的出苗率在0.05水平下進行多重比較。由表3可知，愈傷組織在分化培養(yǎng)基A、B、C、D中均分化出苗，但各培養(yǎng)基間差異顯著，出苗率大小為：A＞B＞D＞C。培養(yǎng)基A的出苗率最高達15%，培養(yǎng)基C的出苗率最低為1.3%。

表3 不同的培養(yǎng)基對花藥愈傷組織分化的影響Table 3 Effect of different culture media on differentiation of callus

2.5 再生植株染色體倍性鑒定

利用根尖染色體計數法對所獲得的23株再生植株進行倍性鑒定。

由表4可知，雙單倍體植株（2n=24）15株，發(fā)生率為65.2%，三倍體植株（2n=36）3株，占總數的13%，四倍體5株，占21.7%。

表4 花藥再生植株的倍性Table 4 Ploidy of anther regenerated plants

3 討論與結論

適量的培養(yǎng)基添加物有利于馬鈴薯花藥培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入20 mg·L-1硝酸銀花藥愈傷誘導率最高，褐化率明顯降低；培養(yǎng)基中添加活性炭濃度為0.5 g·L-1時，效果最佳；添加5%的馬鈴薯提取液有利于馬鈴薯花藥誘導。

3.1 硝酸銀對馬鈴薯花藥培養(yǎng)的影響

許多研究表明，在一定濃度范圍內，硝酸銀能促進單子葉及雙子葉植物愈傷組織的誘導及植株再生[6-12]。硝酸銀能夠促進愈傷組織產生的主要原因是硝酸銀能夠抑制乙稀的產生，延緩花藥褐化衰變所致。肖莉杰等認為硝酸銀在玉米愈傷組織的誘導及其質量的提高方面有一定的作用[13]。張淑紅等發(fā)現，硝酸銀可抑制馬鈴薯葉肉原生質體的褐化，從而提高其細胞分裂頻率[14]。雖然硝酸銀對愈傷組織的誘導和分化有促進作用，但高濃度對植物細胞的生理代謝造成毒害，并導致畸形芽的形成。本研究表明，在一定的濃度范圍內，硝酸銀不僅可以促進愈傷組織的誘導還可防止褐化，這與前人的研究結果一致[13,15]。

3.2 活性炭對馬鈴薯花藥培養(yǎng)的影響

眾所周知，活性炭能吸附培養(yǎng)基中的有害物質，但只是在一定的濃度范圍內有促進作用，當超過一定量時，反而抑制愈傷組織的形成。這是由于活性炭的吸收作用無選擇性，在吸附培養(yǎng)基中有毒物質的同時，也吸附培養(yǎng)基中的生長調節(jié)劑、鐵鹽、維生素等與花藥培養(yǎng)密切相關的物質，可能對花藥培養(yǎng)有抑制作用[16-18]。本試驗活性炭的濃度在0.25～0.50 g·L-1范圍內有利于馬鈴薯花藥培養(yǎng)。

3.3 馬鈴薯提取液對馬鈴薯花藥培養(yǎng)的影響

利用天然植物提取液和多種類植物生長激素及生長物質，如月光花素、落地生根汁液、雜交稻根提取液和水稻幼穗汁液等，以提高水稻花粉植株誘導率和綠苗分化頻率[19-20]。據報道，馬鈴薯提取液可大幅度提高植物花藥培養(yǎng)時愈傷組織及胚狀體的誘導率。戴朝曦研究證明5%的馬鈴薯提取液可明顯提高愈傷組織的誘導率[21]。本試驗結果與其一致，在誘導培養(yǎng)基中加入5%的馬鈴薯提取液有利于花藥培養(yǎng)。

3.4 再生植株倍性鑒定

染色體計數法是確定倍性最基本和最可靠的方法。在單倍體育種中，通過花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)及孤雌生殖等方法獲得的再生植株一般是單倍體、雙單倍體及其他倍性植株的混合群體。本試驗利用根尖染色體計數法對獲得的馬鈴薯再生植株進行了倍性鑒定，明確了各植株倍性。

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