馬淑梅，劉麗君，孫聰姝，董守坤，祖 偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

硫是植物生長(zhǎng)所必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，同碳、氮營(yíng)養(yǎng)一樣，在植物代謝和生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用。大豆籽粒富含蛋白質(zhì)，但含硫氨基酸含量很低，是大豆蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的限制因子。研究大豆硫素代謝的關(guān)鍵酶，對(duì)深入了解大豆品質(zhì)形成影響的關(guān)鍵位點(diǎn)，提高大豆含硫氨基酸含量具有重要意義。

半胱氨酸（Cys）作為硫代謝途徑中最初的還原硫化合物，是蛋氨酸、谷胱苷肽、輔基、維生素、硫脂等硫衍生物的合成前體，是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的必要因素，體現(xiàn)了硫素的生理功能。氧乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶（O-acetyl-L-serine（thiol）-lyase，OAS-TL）和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（Serine acetyltransferase，SAT）以雙酶復(fù)合體的形式存在，通過構(gòu)象變化共同催化OAS與S2+合成半胱氨酸[1-2]。其中，游離型OAS-TL起催化半胱氨酸合成的作用，該反應(yīng)將硫代謝和氮代謝聯(lián)系起來，受硫素營(yíng)養(yǎng)調(diào)控[3]。一般情況下，生物體會(huì)根據(jù)硫酸鹽還原途徑中硫化物的生成量來調(diào)節(jié)OAS的合成，并最終對(duì)整個(gè)硫素吸收和同化進(jìn)行調(diào)控。在高等植物中，已經(jīng)克隆到一族OAS-TL酶的cDNA，并且在大腸桿菌中進(jìn)行了功能表達(dá)。在A.thaliana中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)編碼OAS-TL的基因，分別命名為（oasA1、oasA2、oasB和oasC），分別編碼胞質(zhì)型、線粒體型和葉綠體型OAS-TL[4-5]。目前，大部分關(guān)于OAS-TL活性及表達(dá)的研究都是外界條件短期內(nèi)對(duì)室內(nèi)培育植株刺激的影響，而室外盆栽種植條件下鼓粒期籽粒OASTL的研究少見報(bào)道，本試驗(yàn)擬通過對(duì)大豆氧乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶的克隆及在硫素營(yíng)養(yǎng)下表達(dá)的探索，為進(jìn)一步研究硫素代謝同化調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

盆栽試驗(yàn)品種選用東北春大豆品種東農(nóng)46（高油型）和黑農(nóng)35（高蛋白型）。

1.2 方法

1.2.1 大豆硫素營(yíng)養(yǎng)處理

采用盆栽試驗(yàn)，利用規(guī)格35 cm×15 cm的米氏盆，裝15 kg·盆-1土與砂的混合物（重量比1：1）以降低土壤基礎(chǔ)肥力，測(cè)定有效硫含量為9.3 mg·kg-1，在臨界值（16 mg·kg-1）以下，保證施硫效果。黑農(nóng)35和東農(nóng)46分別設(shè)3個(gè)施硫水平：低硫（S0）、中硫（S20）、高硫（S80），施入純硫量分別為 0、0.02、0.08 g·kg-1土；氮肥施入量為純氮 50 kg·hm-2；磷肥施入量為 75 kg·hm-2；鉀肥施入量為 50 kg·hm-2。硫肥采用硫磺粉；氮肥采用尿素；磷肥采用重過磷酸鈣；鉀肥采用氯化鉀，肥料作為基肥播種前一個(gè)月施入。硫磺粉經(jīng)過氧化后，測(cè)得S20處理有效硫含量為19.7 mg·kg-1，S80處理有效硫含量為77.5 mg·kg-1。每盆播種5粒，定苗3株。每個(gè)處理重復(fù)40次。自鼓粒期開始取籽粒，每隔7 d取1次，共取4次。取樣時(shí)將每5株大豆10節(jié)和11節(jié)上的豆莢取下，撥開豆莢將籽粒取出，用氯仿擦拭混合后包于錫紙并存放于液氮中，最后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱。

1.2.2 OAS-TL活性測(cè)定

稱取籽粒0.5 g，置于預(yù)先冷凍過的研缽中，加入5 mL提取液，冰浴下研磨至勻漿，倒入離心管，4℃下14 000 r·min-1，離心 15 min。取上清 100 μL，加入 1.0 mL 反應(yīng)液（100 mmol·L-1的 Tris-HCl，pH 8.0，內(nèi)含 20 mmol·L-1的 OAS，1 mmol·L-1的Na2S），26℃水浴下反應(yīng)10 min，終止后加入2.5 mL茚三酮溶液（250 mg茚三酮溶于10 mL冰醋酸：濃鹽酸（3：2）的溶液）中，沸水浴10 min后迅速冷卻，加入2 mL冷凍過的100%的乙醇并混合均勻，546 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。以半胱氨酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶活單位為μmol·g-1FW·min-1，表示單位時(shí)間內(nèi)每1 g鮮葉片產(chǎn)生的半胱氨酸量。每個(gè)樣品3個(gè)平行樣，3次重復(fù)[6]。

1.2.3 東農(nóng)46籽?？俶RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按照Trizol Reagent Invitrogen的試劑盒說明書提取東農(nóng)46籽?？俁NA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品OD260/280值在1.8～2.0之間，用 1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA無(wú)明顯降解后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取RNA 2 μg按Prime ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒的操作方法，兩步法完成反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA模板，-20℃保存，用于PCR擴(kuò)增。

1.2.4 OAS-TL的同源克隆

利用Primer Primer 5.0軟件，根據(jù)GenBank提供的大豆OAS-TL基因序列（Accession No.AF452 451）設(shè)計(jì)特異引物。上游引物OAS-TL-F：5′GCT TTGTAGTGAGCAGAT3′，下游引物 OAS-TL-R：5′ATCTGCTCACTACAAAGC3′，在 NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast以保證引物的專一性后，由上海生工合成。PCR反應(yīng)總體積為 20 μL，含10×酶反應(yīng)緩沖液2μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，引物（10mmol·L-1）各 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄所得的 cDNA 0.5 μL，Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0將目的片段回收純化，連接于克隆載體pMD18-T Vector（TaKaRa）上，質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化已制備好的感受態(tài)E.coli DH5α，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性菌落于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日收集菌體，送至上海生物工程公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果拼接，得到序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用DNAMAN6.0軟件對(duì)核酸序列分析及進(jìn)化分析。

1.2.5 大豆籽粒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

方法同1.2.3，經(jīng)紫外/可見光分光光度計(jì)將各處理RNA含量調(diào)到一致。

1.2.6 半定量RT-PCR

參照克隆得到的大豆OAS-TL cDNA序列進(jìn)行半定量引物設(shè)計(jì)。上游引物OAS-TL-1-F：5′TTTG TTTCTGGGATAGGCACT3′，下游引物OAS-TL-1-R：5′CTCAAATAGCACGGAGGACAG3′，預(yù)期長(zhǎng)度470 bp左右；內(nèi)參參照大豆核糖體18S基因。上游引物 18S-F：5′AACCCCGACTTCTGGAAG3′，下游引物 18S-R：5′AACGGAATTAACCAGACAAA3′，預(yù)期長(zhǎng)度1 100 bp左右。采用上述RCR體系，分別采用25、28和31個(gè)循環(huán)，確定指數(shù)擴(kuò)增期，最后確定28個(gè)循環(huán)為宜。擴(kuò)增18S基因，調(diào)整cDNA加入量，使擴(kuò)增出來的條帶在瓊脂凝膠上看起來亮度一致。在28個(gè)循環(huán)條件下，擴(kuò)增目的基因OAS-TL。取PCR產(chǎn)物2 μL，DNA marker 2 μL，1.5%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)后凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫素營(yíng)養(yǎng)對(duì)大豆籽粒OAS-TL的活性影響

自鼓粒期起每隔7 d取樣，研究硫素營(yíng)養(yǎng)對(duì)大豆籽粒OAS-TL活性的影響，結(jié)果見圖1。鼓粒期大豆籽粒OAS-TL隨生育進(jìn)程推進(jìn)活性持續(xù)下降，高油品種東農(nóng)46活性總體上大于高蛋白品種黑農(nóng)35，硫素營(yíng)養(yǎng)在第7、14天作用效果顯著，不同施硫處理間差異明顯。第7天時(shí)，S20處理顯著增加OAS-TL活性，東農(nóng)46和黑農(nóng)35 S20處理分別比對(duì)照高21%和15%，S80增活效果不明顯；在第14天，東農(nóng)46和黑農(nóng)35，S20處理分別比對(duì)照高31%和30%，S80增活效果不明顯；第21天和第28天時(shí)各處理活性差異不大。

2.2 大豆OAS-TL基因序列分析

2.2.1 大豆OAS-TL基因的擴(kuò)增結(jié)果

以提取的東農(nóng)46籽?？俁NA為模板（見圖2），反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，用克隆引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)見圖3。從電泳結(jié)果推測(cè)，克隆片段長(zhǎng)度為1 000 bp左右。

2.2.2 目的片段序列測(cè)定及同源性分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒將目的片段回收純化，連接于克隆pMD18-T Vector載體上，經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性克隆后，送至上海生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆到的大豆氧乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶基因cDNA長(zhǎng)度為1 059 bp，預(yù)測(cè)開放閱讀框架始于第58位堿基，終于第912位堿基，共編碼284個(gè)氨基酸。采用分子生物學(xué)信息分析軟件DNASTAR，預(yù)測(cè)該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為28.49，等電點(diǎn)為5.45。OAS-TL類屬于一大類以磷酸吡哆醛為輔基的超基因家族（PALP）。由圖3可知，大豆OAS-TL氨基酸序列具有該保守功能區(qū)，N端存在保守結(jié)構(gòu)域PXXSVKDR，其中賴氨酸（Lysine）是磷酸吡哆醛的結(jié)合位點(diǎn)（圖4中用括號(hào)已標(biāo)注）。將得到的核酸序列登錄到NCBI網(wǎng)站上，用Blastn程序進(jìn)行序列的同源性檢索發(fā)現(xiàn)東農(nóng)46的OAS-TL核酸序列與其他物種同源性很高，與箭舌豌豆（Vicia sativa）、三葉草（Trifolium subterraneum）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、野生大豆（Glycine soja）親緣很近。

圖4 OAS-TL cDNA核酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列Fig.4 Sequence of nucleic acids and deduced amino acids sequence of OAS-TL cDNA

2.3 硫素營(yíng)養(yǎng)對(duì)大豆OAS-TL基因的表達(dá)影響

取東農(nóng)46和黑農(nóng)35各處理籽粒cDNA經(jīng)18S引物擴(kuò)增調(diào)整模板濃度一致后，再以克隆到的大豆OAS-TL為模板設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增及檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見圖5、6。可知，18S表達(dá)穩(wěn)定，可以作為對(duì)照研究OAS-TL的表達(dá)情況。OAS-TL基因表達(dá)受發(fā)育的調(diào)控，其穩(wěn)定態(tài)mRNA表達(dá)在籽粒發(fā)育早期表達(dá)較強(qiáng)，隨成熟逐漸降低。不同處理下OAS-TL的表達(dá)有差異。在第7天時(shí)，東農(nóng)46和黑農(nóng) 35都表現(xiàn)為S20、S80處理高于對(duì)照處理，硫素長(zhǎng)期匱乏導(dǎo)致OAS-TL的mRNA下調(diào)表達(dá)；在第14天時(shí)，黑農(nóng)35 S20處理顯著高于對(duì)照和S80處理；東農(nóng)46的S20、S80處理都高于對(duì)照，S80下mRNA最強(qiáng)。籽粒成熟后期硫缺乏效果解除。

3 討論與結(jié)論

氧乙酰絲氨酸（硫醇）裂解酶（OAS-TL）是半胱氨酸合成最后一步的關(guān)鍵酶，在半胱氨酸的合成調(diào)節(jié)中占據(jù)核心地位。本研究以東農(nóng)46為材料，設(shè)計(jì)特異性引物，獲得一個(gè)編碼OAS-TL基因的cDNA序列，全長(zhǎng)1 059 bp，ORF長(zhǎng)855 bp，編碼284個(gè)氨基酸。該酶基因類屬于一類以磷酸吡哆醛為輔基的超基因家族（PALP），N端存在保守結(jié)構(gòu)域PXXSVKDR，聚類分析表明，大豆OAS-TL基因與其他植物該基因高度同源。本研究另外采用2個(gè)品種黑農(nóng)35和東農(nóng)46，設(shè)置了3個(gè)硫水平，研究硫素營(yíng)養(yǎng)對(duì)OAS-TL表達(dá)的影響。結(jié)果表明：①2個(gè)品種籽粒OAS-TL活性表現(xiàn)為S20高于S0和S80處理；鼓粒前期施硫效果大于后期。②RT-PCR顯示OAS-TL穩(wěn)定態(tài)mRNA表達(dá)在籽粒發(fā)育早期表達(dá)較強(qiáng)且處理間差異明顯，發(fā)育后期表達(dá)水平逐漸降低。不同硫素處理間OAS-TL的表達(dá)有差異，總體上S20上調(diào)表達(dá)明顯。

按照植物硫營(yíng)養(yǎng)調(diào)控中的需求所驅(qū)動(dòng)的（Demand-driven）原理，硫供應(yīng)在正常水平下，硫同化途徑受到抑制，當(dāng)植物處于需求狀態(tài)且土壤環(huán)境中硫營(yíng)養(yǎng)供給源不足時(shí)，上調(diào)硫營(yíng)養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)與同化代謝水平，既OAS-TL基因表達(dá)應(yīng)上調(diào)以促進(jìn)代謝平衡。但在本研究中，硫素匱乏降低了兩種類型大豆籽粒鼓粒初期OAS-TL的活性及穩(wěn)定態(tài)mRNA的表達(dá)，這與之前的假說有很大的不同。原因可能是大豆植株缺硫的狀態(tài)經(jīng)過苗期、花期，一直持續(xù)到鼓粒期，長(zhǎng)期的硫素匱乏抑制了硫代謝網(wǎng)絡(luò)在植物細(xì)胞內(nèi)多基因和多通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，降低了OAS-TL的活性與表達(dá)，本研究與Hirai等研究結(jié)果一致[7]。

硫素代謝受發(fā)育的調(diào)控，即在較嫩的籽粒中mRNA表達(dá)高于成熟的籽粒，硫素缺乏和過量對(duì)各基因mRNA表達(dá)的影響在此時(shí)明顯，而隨著籽粒的成熟，mRNA表達(dá)下降，伴隨應(yīng)答反應(yīng)消失[8-9]。本研究中OAS-TL活性及基因表達(dá)在籽粒發(fā)育前期較強(qiáng)，后期逐漸下降，這種表達(dá)的發(fā)育調(diào)控模式顯示硫同化主要發(fā)生在生長(zhǎng)活躍的組織中，需要大量的半胱氨酸和甲硫氨酸來進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，而成熟的籽粒中積累的硫酸根在后期的發(fā)育中起到了緩沖的作用。

[1]Droux M,Douce R,Job D,et al.Interactions between serine acety ltransferase and O-acetyl-L-serine(thiol)-lyase in higher plants structural and kinetic properties of the free and bound enzyme[J].Eur J Biochem,1998,255∶235-245.

[2]Wirtz M,Berkowitz O,Droux M,et al.The cysteine synthase complex from plants.Mitochondrial serine acetyltransferase from Arabidopsis thaliana carries a bifunctional domain for catalysis and protein-protein interaction[J].Eur J Biochem,2001,268∶686-693.

[3]Kim H,Hayashi M Y,Chino M,et al.Role of O-acetyl-L-serine in coordinated regulation of the expression of a soybean seeds storage protein gene by sulfur and nitrogen nutrition[J].Planta,1999,209(3)∶282-289.

[4]Hesse H,Altmann T.Molecular cloning of cysteine synthases cDNA from Arabidopsis thaliana[J].Plant Physiol,1995,108∶851-852.

[5]Hell R,Jost R,Berkowitz O,et al.Molecular and biochemical analysis of a the enzymes of cysteine biosynthesis in the plant Arabidopsis thaliana[J].Amino Acids,2002,22(3)∶245-257.

[6]Demosthenis C,Krishnan B.Sulfur assimilation in soybe-an∶Molecularcloningandcharacterization ofO-acetyl-L-serine(thiol)-lyase(cysteinesynthase)[J].CropScience,2003,43∶1819-1827.

[7]Hirai M Y,Fujiwara T,Awazuhara M,et al.Global expression profiling of sulfur-starved Arabidopsis by DNA macroarray reveals the role of O-acetyl-L-serine as a general regulator of gene expression in response to sulfur nutrition[J].Plant,2003,33∶651-663.

[8]Leustek T,Martin M N,Bick J A,et al.Pathway and regulation of sulfur metabolism revealed through molecular and genetic studies[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,2000,51∶141-165.

[9]Blake-Kalff M M A,Harrison K R,Hawkesford M J,et al.Distribution of sulfur within oilseed rape leaves in response to sulfur deficiency during vegetative growth[J].Plant Physiol,1998,118∶1337-1344.