【作者】劉成虎，吳平，施燕平

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，濟(jì)南，250101

隨著越來(lái)越多與血液接觸的醫(yī)療器械在臨床上的使用，大量用于制造該類醫(yī)療器械的固體生物材料被不斷地開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，并取得了良好的臨床使用效果。與此同時(shí)，人們對(duì)這些生物材料的血液相容性的重視程度也在不斷地提高。我們知道，補(bǔ)體是存在于人或脊椎動(dòng)物血清與組織液中的一組不耐熱的、經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，補(bǔ)體激活是宿主的一種重要防御機(jī)制[1,2]。然而，固體生物材料及相應(yīng)血液接觸類醫(yī)療器械激活補(bǔ)體也可能對(duì)宿主產(chǎn)生損害或?qū)е箩t(yī)療器械使用的失效[3,4]，如補(bǔ)體活化釋放的C3a和C5a進(jìn)入血液可導(dǎo)致血管擴(kuò)張、中性粒細(xì)胞聚集及過(guò)敏反應(yīng)；又如C3b可吸附于生物材料的表面，促進(jìn)血小板活化因子的釋放，引起血小板聚集，導(dǎo)致血栓形成。而且，激活的血小板又能通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，從而使血栓形成的趨勢(shì)加劇[5]。另外一些固體生物材料中的外源性蛋白，則可誘導(dǎo)產(chǎn)生與人類蛋白交叉反應(yīng)的IgG或IgM抗體，通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)導(dǎo)致組織損傷。因此，本文就固體生物材料對(duì)血清補(bǔ)體的激活作用機(jī)制以及相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的最新要求進(jìn)行介紹，有助于我們更好地開(kāi)發(fā)和使用固體生物材料及相應(yīng)血液接觸類醫(yī)療器械。

1 固體生物材料補(bǔ)體激活的途徑

固體生物材料與血液接觸以后，可以通過(guò)以下兩條途徑激活機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)（見(jiàn)圖1）。一是經(jīng)典途徑的補(bǔ)體激活，即固體生物材料與血漿中的免疫球蛋白形成抗原-抗體復(fù)合物，依次激活C1、C4、C2，形成C3轉(zhuǎn)化酶（C4b2b）；后者可活化C3，并形成C5轉(zhuǎn)化酶（C4b2b3b）；C5轉(zhuǎn)化酶可活化C5，并依次結(jié)合C6～C9,最終形成膜攻擊復(fù)合物（MAC），從而發(fā)揮補(bǔ)體的生物學(xué)作用。如使用聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）就可發(fā)生這種途徑的補(bǔ)體激活。二是固體生物材料表面的側(cè)鏈基團(tuán)，如羧基、氨基等可與C3分子的磺酸酯基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，并為補(bǔ)體激活提供接觸表面，在血液中的B因子和D因子的作用下，形成C3轉(zhuǎn)化酶（C3bBb）；后者可活化C3并形成C5轉(zhuǎn)化酶（C3bBb3b），最終也形成MAC。如使用硫酸纖維素可發(fā)生補(bǔ)體的旁路途徑激活。同時(shí)，因?yàn)椴恍枰贵w參與，所以旁路途徑補(bǔ)體激活的時(shí)間要早于經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活的時(shí)間。

2 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)與循環(huán)血液接觸器械適用補(bǔ)體試驗(yàn)的新要求

圖1 固體生物材料的補(bǔ)體激活途徑Fig.1 Complement activation approach by solid biomaterial

我們知道，血液接觸類醫(yī)療器械臨床使用風(fēng)險(xiǎn)一般比較高，所以市場(chǎng)準(zhǔn)入門(mén)檻也就比較高。我國(guó)將其歸為第三類醫(yī)療器械，即植入人體，用于支持、維持生命，對(duì)人體具有潛在危險(xiǎn)，對(duì)其安全性、有效性必須嚴(yán)格控制的醫(yī)療器械。并且，該類器械產(chǎn)品的注冊(cè)技術(shù)審評(píng)工作，一律由國(guó)家醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)機(jī)構(gòu)執(zhí)行。不僅我國(guó)如此，美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)對(duì)該類醫(yī)療器械安全性控制也非常嚴(yán)格。相關(guān)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)要求也在不斷地更新。ISO 10993系列標(biāo)準(zhǔn)中醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇（GB/T 16886.4）在2006年發(fā)布該部分標(biāo)準(zhǔn)的修改單[ISO 10993-4:2002/Amd.1:2006(E)][6]在修改單中增加了適用補(bǔ)體試驗(yàn)的與循環(huán)血液接觸器械的種類，并將其與溶血、血栓形成、凝血一起列為血液接觸類醫(yī)療器械血液相容性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了該試驗(yàn)在醫(yī)療器械血液相容性評(píng)價(jià)中的重要地位（見(jiàn)表1，表2）。

表1 與循環(huán)血液接觸器械部件（外部接入器械）Tab.1 Circular blood Contacting medical devies(extrinsic)

表2 與循環(huán)血液接觸器械部件（植入器械）Tab.2 Circular blood Contacting medical devies(embedded)

從表1和表2中可以看出，新版國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)與血液接觸時(shí)間較長(zhǎng)和接觸程度較高的器械，基本上都列入了補(bǔ)體激活試驗(yàn)的要求，這符合該類醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)的發(fā)展趨勢(shì)。雖然ISO 10993系列標(biāo)準(zhǔn)的本部分適用于成品醫(yī)療器械，但這同時(shí)也彰顯出對(duì)固體生物材料及相應(yīng)血液接觸類醫(yī)療器械補(bǔ)體激活作用研究的重要性。

3 如何選用固體生物材料補(bǔ)體激活作用的標(biāo)準(zhǔn)

目前，國(guó)際上還沒(méi)有統(tǒng)一、認(rèn)可的檢測(cè)固體生物材料及相應(yīng)醫(yī)療器械補(bǔ)體激活作用的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。雖然國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室中用于固體生物材料補(bǔ)體激活作用檢測(cè)的方法很多，但大多只限于從補(bǔ)體活性片段數(shù)量的角度來(lái)分析，沒(méi)有涉及到補(bǔ)體的功能檢測(cè)，并且實(shí)驗(yàn)成本一般比較高，同時(shí)在可靠性、重現(xiàn)性和預(yù)示臨床性能方面尚存缺陷。因此，有必要對(duì)補(bǔ)體激活試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及如何選用這些標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行介紹，為固體生物材料補(bǔ)體激活作用的檢測(cè)提供新的思路。

3.1 通過(guò)補(bǔ)體關(guān)鍵分子數(shù)量來(lái)檢測(cè)補(bǔ)體激活作用

固體生物材料及相應(yīng)的醫(yī)療器械與血液接觸后，如激活補(bǔ)體，首先表現(xiàn)出來(lái)的是血清補(bǔ)體關(guān)鍵分子的改變，如C3數(shù)量的減少，GB/T 14233.2-2005中提供了相應(yīng)補(bǔ)體分子的檢測(cè)方法。該標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)與對(duì)照組相比，體外檢測(cè)血清補(bǔ)體活化期間所形成C3a的量來(lái)判定醫(yī)療器械對(duì)人血清補(bǔ)體激活情況，從而推斷醫(yī)療器械的補(bǔ)體激活潛能[7]。其它可用于檢測(cè)的補(bǔ)體分子還包括C5a、Bb和C4d等。目前，人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出各種商品化的試劑盒，來(lái)針對(duì)這些補(bǔ)體分子的檢測(cè)，因此操作十分方便，且適用于多種固體生物材料和相應(yīng)醫(yī)療器械補(bǔ)體激活潛能的檢測(cè)。但如果想深入了解固體生物材料的補(bǔ)體激活作用，還需進(jìn)一步分析補(bǔ)體的功能。

3.2 通過(guò)血清總補(bǔ)體功能變化來(lái)檢測(cè)補(bǔ)體激活作用

3.2.1 CH50

血清總補(bǔ)體功能活性的改變，可直觀地反映固體生物材料及相應(yīng)醫(yī)療器械的補(bǔ)體激活作用。因此，總補(bǔ)體功能活性的檢測(cè)可用作補(bǔ)體激活試驗(yàn)的常規(guī)篩選試驗(yàn)。CH50是測(cè)定血清總補(bǔ)體活性的最簡(jiǎn)單的方法，它的降低可表明血清總補(bǔ)體的消耗[8]。雖然實(shí)驗(yàn)室常通過(guò)觀察CH50的改變來(lái)判定血清總補(bǔ)體的活性，但該項(xiàng)試驗(yàn)的特異性不高，且易受環(huán)境和操作者的影響，因此一般不推薦將其用于固體生物材料補(bǔ)體激活作用的篩選。

3.2.2 ASTM F 1984-99

美國(guó)材料協(xié)會(huì)于1999年發(fā)布了一個(gè)簡(jiǎn)單、廉價(jià)的用于測(cè)定固體生物材料對(duì)血清總補(bǔ)體的功能性體外激活作用的技術(shù)規(guī)范，即ASTM F 1984-99[9]。該規(guī)范主要包括兩個(gè)步驟：步驟A中將固體材料與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量的人血清接觸；步驟B中通過(guò)檢測(cè)補(bǔ)體介導(dǎo)的綿羊紅細(xì)胞裂解情況，測(cè)定接觸血清內(nèi)總補(bǔ)體的顯著功能性缺失。

ASTM F 1984-99可用于多種生物材料補(bǔ)體激活作用的檢驗(yàn)，如醋酸纖維素、乳膠等。該規(guī)范雖然從功能上檢驗(yàn)了固體生物材料補(bǔ)體激活的情況，但是在激活機(jī)制上不能區(qū)分是經(jīng)典途徑激活還是旁路途徑激活。事實(shí)上，微量激活物仍可能產(chǎn)生足量的裂解產(chǎn)物（C3a、C5a等），產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，但卻不會(huì)引發(fā)總補(bǔ)體活性的顯著改變。所以，該規(guī)范推薦的檢測(cè)方法對(duì)微弱補(bǔ)體激活物的敏感性不足，不適用于一些弱補(bǔ)體激活作用的固體生物材料，故需將獲得的結(jié)果與其它的試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合考慮，如旁路途徑的補(bǔ)體激活，共同評(píng)定試驗(yàn)材料的補(bǔ)體激活特性。

3.3 其他補(bǔ)體激活試驗(yàn)的選擇

3.3.1 ASTM F2065-00

固體生物材料及相應(yīng)器械與血液接觸后，最先被激活的補(bǔ)體通路為旁路途徑。因此，旁路途徑激活對(duì)植入器械或外部接入血液器械用固體生物材料的篩選有重要意義。ASTM F2065-00就是一種評(píng)價(jià)固體生物材料旁路途徑補(bǔ)體激活潛能的方法[10]。該規(guī)范的步驟A是將固體生物材料與標(biāo)準(zhǔn)量的C4缺失的豚鼠血清[C4（-）GPS]接觸；步驟B則是通過(guò)檢測(cè)補(bǔ)體介導(dǎo)的兔紅細(xì)胞裂解情況，來(lái)分析接觸血清中功能性補(bǔ)體的活性。

C4（-）GPS不支持經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活，因此ASTM F2065-00是固體生物材料旁路途徑補(bǔ)體激活的特異性試驗(yàn)，特異性和敏感性都優(yōu)于總補(bǔ)體活性的檢測(cè)，故適用于篩選多種固體生物材料及相應(yīng)醫(yī)療器械的補(bǔ)體激活特性。但與此同時(shí)，ASTM F2065-00中未涉及補(bǔ)體激活后具體效應(yīng)分子的免疫功能，因此它也不是評(píng)價(jià)所有固體生物材料補(bǔ)體激活潛能最敏感和最特異的方法。如需要對(duì)單個(gè)補(bǔ)體裂解產(chǎn)物（如Bb和C4d等）進(jìn)行免疫分析，還宜考慮生物材料對(duì)補(bǔ)體蛋白的非特異性吸附或通路激活[11]。

3.3.2 體內(nèi)補(bǔ)體激活試驗(yàn)

除了體外補(bǔ)體激活試驗(yàn)，過(guò)去人們還常用免疫化學(xué)法來(lái)定量分析體內(nèi)補(bǔ)體激活所產(chǎn)生的補(bǔ)體片段，進(jìn)而評(píng)定補(bǔ)體激活作用。最近，Martin[12]等還應(yīng)用特異性單克隆抗體法來(lái)研究體內(nèi)補(bǔ)體激活時(shí)所產(chǎn)生的補(bǔ)體片段，并取得了較好的結(jié)果。但是，鑒于血漿補(bǔ)體分子的多樣性，且這些補(bǔ)體分子在體內(nèi)條件下又會(huì)被迅速代謝，更增加了體內(nèi)補(bǔ)體激活試驗(yàn)的復(fù)雜性。因此，目前還不推薦將其用于固體生物材料及相應(yīng)醫(yī)療器械補(bǔ)體激活潛能的檢測(cè)。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

多年來(lái)，血清補(bǔ)體激活作用一直是固體生物材料血液相容性研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-4中也將補(bǔ)體活性產(chǎn)物的檢測(cè)，列入評(píng)價(jià)血液接觸類醫(yī)療器械血液相容性的一部分。然而，目前人們對(duì)固體生物材料的補(bǔ)體激活作用的認(rèn)識(shí)還有許多不足之處，具體表現(xiàn)在：（1）目前用于檢測(cè)固體生物材料補(bǔ)體激活的方法眾多，且不統(tǒng)一，因此缺乏相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)規(guī)范該項(xiàng)要求；（2）因?yàn)楝F(xiàn)有的ISO 10993系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)某些生物可降解材料、納米材料以及組織工程產(chǎn)品評(píng)價(jià)的不適用性，對(duì)這些材料的補(bǔ)體激活作用研究乃至血液相容性的評(píng)價(jià)將如何進(jìn)行？（3）補(bǔ)體激活一般為急性期反應(yīng)，但是慢性局部補(bǔ)體激活對(duì)醫(yī)療器械正常功能發(fā)揮的影響及具體機(jī)制還不明確；（4）其他形態(tài)的生物材料及相關(guān)器械中的添加劑、加工助劑等對(duì)補(bǔ)體的激活機(jī)制是什么？如Lamba 等[13]在體外研究醫(yī)用聚氯乙烯（PVC）對(duì)接觸血液影響時(shí)就發(fā)現(xiàn)，PVC中溶出的增塑劑DEHP是一種較強(qiáng)的補(bǔ)體激活劑，可激活補(bǔ)體產(chǎn)生C3a。雖然以上問(wèn)題還有待進(jìn)一步的研究和確認(rèn)，但是我們有理由相信，隨著生物材料和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)生物材料的補(bǔ)體激活機(jī)制的研究將會(huì)日趨成熟。

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