陳益山,鞏忠福,姜代勛,李 佳,陳 麗,任 超,穆 祥,陳 武

(1.獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室,北京 昌平 102206;2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 昌平 102206;3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀 100081)

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lacti f lora Pall)的干燥根,具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗之功效[1]。藥理研究表明,其有抗炎、解痙、護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)等作用。研究表明,臨床上常見炎癥性疾病多與中性粒細(xì)胞的炎性反應(yīng)密切相關(guān)[2-3],而磷酸二酯酶(PDE)可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平發(fā)揮抗炎作用[4],本試驗通過檢測白芍水提物對中性粒細(xì)胞PDE活性和炎癥病理模型的影響,分析其抗炎的相關(guān)機(jī)理與效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠60只,體重150～180 g,購于中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 cAMP、Rolipram、角叉菜膠、弗氏完全佐劑(Sigma公司),PBS(pH值7.4),鈣鎂PBS(pH值7.4),中藥白芍飲片(北京同仁堂藥店)。

1.3 白芍水提物的制備 白芍水提物的制備方法參照韓太云等人的方法[5],將購買的白芍飲片用蒸餾水淋洗1次,加蒸餾水煎煮2次,煎液減壓濃縮至1 g/mL生藥。加無水乙醇使其濃度達(dá)到70%,邊加邊攪拌,4℃放置24 h,取上清液用氫氧化鈉調(diào)pH值為7.5～8.0,放置12 h,取上清液揮發(fā)掉乙醇,將藥液濃縮至1 g/mL生藥。放置12 h,離心取上清液濃縮干燥,得白芍水提物。

1.4 中性粒細(xì)胞cAMP-PDE活性檢測 中性粒細(xì)胞cAMP-PDE活性影響的檢測方法參考張冰等的方法[6]。cAMP濃度為100 μ mol/L,白芍水提物的反應(yīng)濃度為10 mg/mL,陽性對照為Rolipram,反應(yīng)濃度為 100 μ mol/L,均用 PBS配制?？瞻捉M:cAMP 40μL,對照組 :cAMP 40μL 、酶樣品 20μL,白芍水提物組:cAMP 40μ L、白芍水提物 10μL、酶樣品 20μL,Rolipram 組:CAMP 40μ L 、Rolipram 10.0μL、酶樣品 20μL,所有體系加 PBS 補(bǔ)足100μL 。

1.5 大鼠角叉菜膠致足腫脹模型試驗 將大鼠隨機(jī)分成6組,每組10只。白芍水提物設(shè)高、中、低3個濃度,分別小鼠腹腔注射白芍水提物10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg體重;陽性對照組,腹腔注射Rolipram 2.75 mg/kg體重;正常對照組和模型組,腹腔注射等容積的生理鹽水。給藥30 min后,正常對照組每鼠右后足跖皮下注射0.1mL生理鹽水,其余各組每鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜膠0.1mL造模。致炎前按照余華保等人[7]的玻璃容器法測定大鼠右后足跖的容積,致炎后2,4 h和6 h再測量3次,以mL為單位計算其腫脹。以致炎前后足跖容積的差值計算腫脹度,并算出各用藥組的抑制率,腫脹抑制率=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

1.6 大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型試驗 分組給藥同上1.5。正常對照組每鼠左后足跖皮下注射0.05mL的生理鹽水,其余各組每鼠左后足跖皮下注射完全弗氏佐劑0.05mL造模。致炎前用千分尺測量大鼠左后足跖的厚度,致炎后3 h、6 h、15 h再測量3次,以mm為單位計算其腫脹。以致炎前后足跖厚度的差值計算腫脹度,并算出各用藥組的抑制率。

1.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析采用樣本間t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芍水提物對中性粒細(xì)胞cAMP-PDE活性的影響 白芍水提物在10 mg/mL的反應(yīng)濃度下,能極顯著的抑制cAMP-PDE4的活性(P＜0.001),其抑制率顯著高于Rolipram組。結(jié)果見表1。

表1 白芍水提物及Rolipram對cAMP-PDE活性的影響

2.2 白芍水提物對大鼠角叉菜膠致足腫脹的影響與空白對照組相比較,模型組致炎后大鼠足跖容積極顯著性變大(P＜0.001),說明造模成功。白芍水提物各濃度組及Rolipram組對大鼠足腫脹在致炎后2 h、4 h和6 h均有顯著抑制作用(P＜0.05),并且隨劑量的增加,其足腫脹度逐漸減小,抑制率逐漸提高,結(jié)果見表2和表3。

2.3 白芍水提物對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響 模型組大鼠左后足跖極顯著腫脹(P＜0.001)。白芍水提物各濃度組及Rolipram組給藥后的大鼠原發(fā)性足跖腫脹均受到顯著的抑制(P＜0.05),并且隨劑量的增加,其足跖腫脹度逐漸減小,抑制率逐漸提高,結(jié)果見表4和表5。

3 討論

大部分研究報道所用白芍的成分都是通過有機(jī)溶劑乙醇萃取獲得[8],考慮到傳統(tǒng)中藥均采用水煎煮的方法,水溶性成分可能更能真正代表其傳統(tǒng)作用成分。因此,本試驗通過水提醇沉法提取了白芍中的水溶性成分,檢測其對cAMP-PDE活性的影響,觀察其抗炎效果并分析機(jī)理。

表2 白芍水提物對大鼠足腫脹的影響 (mL)

表3 白芍水提物各組大鼠足爪腫脹度(mL)和抑制率(%)

表4 白芍水提物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹度的影響 (mm)

表5 白芍水提物各組大鼠足跖腫脹度(mm)和抑制率(%)

結(jié)果表明,白芍水提物對中性粒細(xì)胞中cAMPPDE活性具有極顯著的抑制作用。并且對大鼠角叉菜膠致大鼠足腫脹和佐劑性關(guān)節(jié)炎的足腫脹兩種炎癥模型均顯示出了極顯著的抗炎效果,并與劑量呈正相關(guān)。大鼠角叉菜膠致大鼠足腫脹和佐劑性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與炎癥局部中性粒細(xì)胞活化和浸潤及前列腺素E2合成增加有關(guān)[9-10],而cAMP具有抑制中性粒細(xì)胞活化及前列腺素 E2過度合成的作用。PDE是cAMP的惟一水解酶,對調(diào)節(jié)細(xì)胞PDE水平起著關(guān)鍵性作用。因此,白芍水提物的作用可能是通過抑制PDE活性,升高cAMP水平,進(jìn)而抑制大鼠角叉菜膠致足腫脹和佐劑性關(guān)節(jié)炎的足跖腫脹部位中性粒細(xì)胞活化和浸潤及前列腺素E2增加,從而發(fā)揮良好的抗炎效果。

白芍水提物中含有的具體抗炎成分及臨床抗炎療效有待進(jìn)一步研究。

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