高明華,張志琰,樊慶徳,楊曉剛,夏咸柱

(1.呼倫貝爾學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,吉林 長春 130062)

狂犬病病毒(RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssavirus),是人獸重要共患狂犬病的病原[1-2]。根據(jù)血清學(xué)試驗和種屬發(fā)生規(guī)律,已知的狂犬病病毒及狂犬病相關(guān)病毒分為5個血清型[3-4]和7個基因型[5-7]。7個基因型又分屬兩個不同的遺傳進化群[8]。基因Ⅰ型包括在自然界中流行的野毒株和固定毒株(如 ERA、SRV9、CVS、PV、Flury、aG株等)。RV結(jié)構(gòu)蛋白包括核蛋白(N)、糖蛋白(G)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)和依賴RNA的RNA多聚酶(L)。糖蛋白是狂犬病病毒的主要保護性抗原,是惟一誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的蛋白,其免疫作用與全病毒疫苗相當(dāng)[9-10]。鑒于糖蛋白在RV結(jié)構(gòu)中的重要地位和在免疫上的重要作用,我們對RV ERA株G蛋白基因進行了克隆和序列分析,以期了解該毒株G基因的分子生物學(xué)背景和G蛋白的抗原性,同時也為進一步研究狂犬病安全有效的基因工程疫苗和新型檢測方法奠定必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒、菌種與主要試劑 RV ERA株由本實驗室保存;反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNase抑制劑、T4DNA 連接酶 、dNTPs、pMD18-T 載體、限制性內(nèi)切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司;經(jīng)典總RNA抽提試劑盒、Taq plus DNA聚合酶和DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;E.coli JM109由本實驗室保存。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank公布的RV G基因序列,并分析其內(nèi)部酶切位點,設(shè)計了1對特異性引物。上游引物:5′-AGCGAATTCGATGGT TCCTCAGGCTCTCCTGTT TG-3′,下游引物 :5′-TTAG CGGCCGCCTCACAGTCT -GGTCTCACCCCCA-3′為進一步克隆和構(gòu)建表達載體需要,分別在上、下游引物的5′端引入 EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(下劃線部分),并加3個保護性堿基。

1.3 病毒培養(yǎng)及總RNA提取 按常規(guī)方法培養(yǎng)病毒。采用經(jīng)典總RNA抽提試劑盒提取總RNA。

1.4 RV ERA株G基因RT-PCR擴增、克隆與序列分析 RT-PCR擴增目的基因,產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析,回收目的DNA片段,并與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 JM109,并用Amp+LB瓊脂平板篩選。酶切鑒定重組質(zhì)粒,正確者命名為pMD-G,送上海聯(lián)合基因生物公司進行測序[11-12]。用軟件分析序列并與其他毒株G基因進行同源性比較。

1.5 ERA株與其他不同毒株G基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列分析 用分子生物學(xué)軟件對測定的G基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析;ERA株與GenBank上登錄的其他國內(nèi)外不同RV毒株糖蛋白主要抗原表位、糖基化位點和神經(jīng)毒性殘基等進行比較和分析。

2 結(jié)果

2.1 G基因的擴增與克隆 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,擴增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致(圖1)?；厥赵撈?用pMD18-T載體克隆,篩選得到重組質(zhì)粒pMD-G,經(jīng)EcoRⅠ酶切,得到約4267 bp的DNA大片段;經(jīng)EcoRⅠ和 NotⅠ雙酶切,得到約1575 bp的插入DNA片段和2692 bp的載體大片段,表明G基因已克隆入 T載體中(圖2)。以pMD-G為模板,用特異性引物進行PCR擴增,得到了1575 bp大小的核酸片段,表明已正確克隆了G基因。

2.2 序列測定結(jié)果及ERA株與其他毒株G基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比較 序列測定結(jié)果,RV ERA株G蛋白基因全長1575 bp,編碼524個氨基酸。分析表明,在推導(dǎo)的G蛋白氨基酸序列中,第1～19位和440～461位氨基酸是兩個明顯的疏水區(qū),前一個疏水區(qū)構(gòu)成該蛋白的信號肽序列,后一疏水區(qū)推測是該蛋白的跨膜區(qū)。測序結(jié)果與GenBank登錄的RV ERA株核苷酸序列完全一致,說明本室保存的毒株在連續(xù)傳代過程中沒有發(fā)生變異。

ERA株與GenBank中發(fā)表的其他基因 I型RV毒株相比,G基因核苷酸的同源性為89.1%～99.1%,推導(dǎo)氨基酸序列的同源性為89.7%～99.3%。序列比較發(fā)現(xiàn),不同RV各固定毒株糖蛋白的氨基酸同源性有一定的差異,其中穿膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)差異較大(同源性50%～60%),而膜外區(qū)的保守性略高(同源性大于90%)。

2.3 糖基化位點與神經(jīng)毒性殘基分析 用PROSITE軟件分析發(fā)現(xiàn),推導(dǎo)的RV ERA株G蛋白上存在3個潛在的N-聯(lián)糖基化位點(Asn37,247,319),與RV其他毒株相比糖基化位點數(shù)目和部位略有差異(CVS株為Asn37,319;PV株為Asn37,158,247,319;HEP株為Asn37,158,204,319;Kelev株為 Asn37,319;Mokola株 Asn202,319),其中第Asn37位糖基化位點為基因I型RV共同擁有的,而Asn319位糖基化位點為多數(shù)野毒株和固定毒株共同擁有的。

糖蛋白神經(jīng)毒性殘基分析,ERA株、PV株和CVS株均為Arg333;HEP株為Glu333;Kelev株為Gln333;Mokola為Asp333。

2.4 G蛋白主要抗原表位分析 RV ERA株與SRV9、PV和CVS等標(biāo)準(zhǔn)毒株相比較,G蛋白在疏水性、Jameson-Wolf抗原表位和表面極性均有其明顯的特點。Jameson-Wolf抗原表位分析表明,與PV-11相比,在175-183位氨基酸殘基上抗原表位指數(shù)明顯升高;CVS相比,在145-154、423-430、492-500位氨基酸殘基上抗原表位指數(shù)明顯升高,而在380-392位氨基酸殘基上抗原表位指數(shù)明顯降低;與SRV-9相比,在 185-195位、273-280位氨基酸殘基上抗原表位指數(shù)明顯降低。

另外,在推導(dǎo)的RV ERA株G蛋白序列N端260～267位氨基酸也存在一個非常保守的序列‘LHDFRSDE',此序列是G蛋白抗原表位V-線性表位的核心,該表位由位于254～275位的氨基酸殘基組成,在目前所測序的毒株(包括固定毒株和分離株)中均非常保守。

3 小結(jié)與討論

3.1 成功克隆和表達了狂犬病病毒ERA株G基因。糖蛋白位于狂犬病病毒分子表面,是病毒的保護性抗原,占病毒總蛋白的40%。其糖基化位點與神經(jīng)毒性殘基分析結(jié)果表明,由于該疫苗株存在Asn319位糖基化位點,與多數(shù)野毒株和固定毒株共同擁有的;并且,糖蛋白第333位氨基酸為神經(jīng)毒性殘基Arg333,因此全病毒有一定的潛在神經(jīng)毒性,只可用于滅活疫苗的制備。由于RV ERA株糖蛋白有明顯的優(yōu)勢抗原表位,因此可用G基因作為靶基因研制安全有效的基因工程疫苗。

3.2 狂犬病是人類和多種動物致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病。在我國狂犬病發(fā)生主要分布在南方部分省區(qū),且近幾年呈上升趨勢,穩(wěn)居我國法定報告?zhèn)魅静“l(fā)病總數(shù)和死亡總數(shù)之第二位,病死率和死亡率則位居各傳染病首位,犬是最主要的儲存宿主和傳播宿主。因此研制安全有效的獸用疫苗和建立特異敏感的快速診斷方法對于防制狂犬病是非常必要的。我們對RV ERA株進行了詳細的分子生物學(xué)研究,對該毒株G、N等兩種主要結(jié)構(gòu)蛋白基因進行了克隆和序列分析,并進行了表達,其目的為進一步研制安全有效的基因工程疫苗和快速診斷試劑,奠定良好的基礎(chǔ)。

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