曹金鎖,柳 超,蔣朋飛,趙振華,陳新雨,張德禮

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院病毒免疫與生物信息研究室生物信息研究中心分子病毒免疫與腫瘤系統(tǒng)生物學(xué)研究組,陜西 楊凌 712100)

先天性免疫是機(jī)體防御病原體感染的第一道防線,而ak irin2是先天性免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要功能基因[1-2]。Akirin2蛋白嚴(yán)格定位于細(xì)胞核,參與NF-κ B通路,但其作用機(jī)制尚未明確。小鼠akirin2基因敲除試驗(yàn)表明,Akirin2蛋白是Toll樣受體,腫瘤壞死因子和白介素1受體信號通路中的重要核因子[1]。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證實(shí),該蛋白的過量表達(dá)能明顯促進(jìn)IL-6和其他免疫因子的表達(dá)[1,3]。為探討akirin2基因在豬體內(nèi)的功能,本研究結(jié)合生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)試驗(yàn),依照人akirin2基因序列克隆到豬源a k irin2基因,對基因進(jìn)行染色體定位預(yù)測與蛋白進(jìn)化分析,從序列本身掌握ak irin2基因特點(diǎn)。構(gòu)建真核表達(dá)載體成功進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,為深入研究ak irin2奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織和細(xì)胞來源 健康長白豬的脾臟;豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系(SUVEC)為張彥明教授饋贈;pEGFP-C1質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司;RTPCR試劑盒購自Fermentas;Taq DNA,內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ均購自TaKaRa(大連)公司;抗GFP抗體,膠回收試劑盒購自天根公司;羊抗鼠 IgG/HRP購自北京博奧森公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司;Lipofectamine 2000 Regent購自Invitrogen公司;胎牛血清購自 Hyclone公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.3 豬akirin2基因的電子克隆與引物設(shè)計(jì) 登陸NCBI,以人 a k irin2基因(NC_000006.11)為種子序列,在豬EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對拼接得到豬a kirin2基因預(yù)測序。設(shè)計(jì)引物為上游5′-GAGTCGAC ATGGCGTGCGGAGCTACT-3′,下游 5′-GACGGGA TCCGTCATGAAACATAACTAGCAG -3′,GTCGAC:SalⅠ酶切位點(diǎn);GGATCC :BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

1.4 akirin2基因的克隆和鑒定 取健康長白仔豬的脾臟,采用Trizol法提取總RNA,RT-PCR法得到ak irin2的編碼區(qū),將 PCR產(chǎn)物與 pMD-18TSimple載體連接,菌液送到北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.5 ak irin2基因序列分析 在線軟件(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp)預(yù)測 NLS(Nuclear localization signal)[4],使用APSSP2在線軟件(http://www.imtech.res.in/raghava/apssp2)對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[5]。CluxtalX 1.8軟件將多物種的Akirins蛋白序列進(jìn)行多序列比對,使用MEGA4.0軟件做進(jìn)化樹[1-6]。

1.6 ak irin2基因真核載體的構(gòu)建與鑒定 將pMD-akirin2重組質(zhì)粒進(jìn)行SalⅠ和BamHⅠ雙酶切,pEGFP-C1質(zhì)粒經(jīng)過同樣的雙酶切和膠回收,將pEGFP-C1和目的片段akirin2在 T4連接酶作用下4℃過夜,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,將重組質(zhì)粒送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.7 SUVEC培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 培養(yǎng)豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(SUVEC),細(xì)胞形態(tài)為鋪路石狀,用含10%胎牛血清的高糖DMEM進(jìn)行培養(yǎng),每3 d傳代1次。將細(xì)胞培養(yǎng)在六孔板中,按照脂質(zhì)體2000操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染,24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況[8]。

1.8 Western blot檢測目的蛋白 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》做Western blot檢測目的蛋白,一抗為抗GFP抗體(工作濃度為1∶2000),二抗為羊抗鼠IgG/HRP(工作濃度為1∶3000)。

2 結(jié)果

2.1 通過RT-PCR法得到目的序列 從豬脾臟中提取RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相一致的核酸片段。

2.2 序列分析結(jié)果 豬Akirin2編碼203個(gè)氨基酸,第22～27位氨基酸(PKRRRC)序列為核定位序列,該蛋白以Coil(無規(guī)卷曲)和α-Helix(α-螺旋)為主。豬akirin2基因被準(zhǔn)確定位在豬第1號染色體上,此段豬基因組序列登陸號為CU633759,在第164313-185326位之間。外顯子分別編碼78個(gè)氨基酸,48個(gè)氨基酸,50個(gè)氨基酸和27個(gè)氨基酸。3個(gè)內(nèi)含子大小分別為16441 bp,2406 bp和1358 bp。

2.3 豬Akirin2蛋白進(jìn)化分析 最小進(jìn)化法構(gòu)建的無根進(jìn)化樹顯示:豬的Akirin2蛋白與牛的Akirin2蛋白保持高度的同源性。同時(shí)各物種間的Akirin2進(jìn)化保守型要高于 Akirin1。進(jìn)化樹明顯分為三大部分:無脊椎動物的Akirin,脊椎動物的Akirin1和脊椎動物的Akirin2[1-3]。圖中符號標(biāo)示:Dm,(果蠅);Ag,(按蚊);Am,(蜜蜂);Tc,(赤擬谷盜);Gg,(雞);Hs,(人);Mm,(小鼠);Xl,(爪蟾);Dr,(斑馬魚);Bt,(牛);Ss,(豬)。

2.4 真核重組質(zhì)粒pEGFP-Akirin2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果在轉(zhuǎn)染24 h后,使用熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的SUVEC細(xì)胞。a和b分別為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SUVEC細(xì)胞,a為熒光下細(xì)胞形態(tài),b為同一細(xì)胞區(qū)域自然光下細(xì)胞形態(tài);c為空 pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SUVEC細(xì)胞結(jié)果。d為未轉(zhuǎn)染的EC細(xì)胞。通過熒光觀察初步判定目的蛋白已在SUVEC細(xì)胞中表達(dá)。見圖2。

圖2 pEGFP-Akirin2和pEGFP-C1轉(zhuǎn)染SUVEC細(xì)胞24 h后熒光顯微鏡檢測(100×)

2.5 Western blot檢測結(jié)果 Akirin2蛋白分子量為22.5 ku,EGFP蛋白自身蛋白分子量為27 ku,則EGFP-Akirin2融合蛋白分子量為 49 ku左右。Western blot檢測出的融合蛋白大小與預(yù)期分子量一致,證明EGFP-Akirin2融合蛋白在SUVEC細(xì)胞中得到表達(dá)。見圖3。

3 討論

圖3 Western blot檢測

比較基因組學(xué)與基因數(shù)據(jù)庫的共享為基因識別提供了條件。人基因組與豬基因組存在較高的同源性,以人的基因序列為種子序列,在豬EST數(shù)據(jù)庫和基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行豬新基因的識別與克隆,為研究豬感染與免疫新基因提供新途徑。本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)得到豬Akirin2完整編碼區(qū)證實(shí)了豬ak irin2基因確實(shí)存在。將編碼區(qū)與豬基因組序列比對,結(jié)合內(nèi)含子首尾的GT-AT規(guī)律,確認(rèn)豬akirin2基因含有4個(gè)外顯子并定位于豬1號染色體。這一結(jié)果可為研究Akirin2蛋白功能提供參考價(jià)值,為研究各個(gè)外顯子功能和Akirin2蛋白構(gòu)象提供幫助。通過構(gòu)建多物種Akirin進(jìn)化樹為研究各物種之間的進(jìn)化關(guān)系提供佐證,為從進(jìn)化角度研究低等動物與高等動物之間Akirin調(diào)控異同提供數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)成功將a k irin2基因構(gòu)建到pEGFPC1真核表達(dá)載體上,實(shí)現(xiàn)豬 a k irin2基因在SUVEC細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá),保持了Akirin2蛋白的原有構(gòu)象,為進(jìn)一步研究akirin2基因功能奠定基礎(chǔ)。由于豬和人的基因組序列和蛋白質(zhì)有著高度同源性,因此以豬為模型研究哺乳動物免疫調(diào)控機(jī)制,將直接為研究人體相應(yīng)蛋白提供數(shù)據(jù)支持。單獨(dú)的Akirin2蛋白并不起作用,因此要完全了解Akirin2的功能還需要同時(shí)研究多個(gè)免疫相關(guān)基因[1]。

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