趙 耘,杜昕波,李偉杰,陳 敏,康 凱

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀 100081)

多殺性巴氏桿菌是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體,主要使動(dòng)物發(fā)生出血性敗血癥或傳染性肺炎。本菌廣泛分布于世界各地。在同種或不同動(dòng)物間可相互傳播,也可感染人。Carter G R等根據(jù)莢膜抗原的不同將本菌分為A、B、D、E和F五個(gè)血清型[1]。多殺性巴氏桿菌不同型之間其生物學(xué)差異很大,主要表現(xiàn)毒力和流行病學(xué)方面,各血清型之間交叉免疫保護(hù)性較低。已經(jīng)證明KMT1基因是多殺性巴氏桿菌種特異性基因,而A、B、D、E莢膜型的特異基因則分別是 hyaD、bcbD、dcbD和 ecbJ基因[2-3]。本研究參照文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)上述特異基因合成6對(duì)引物建立多重PCR方法,并利用所建立的多重PCR方法對(duì)我所保存的48株不同動(dòng)物來(lái)源的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行鑒定和莢膜血清型分型,同時(shí)與間接血凝試驗(yàn)以及Biolog細(xì)菌快速鑒定系統(tǒng)進(jìn)行比對(duì),以期為巴氏桿菌病的臨床快速診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 多殺性巴氏桿莢膜型菌參考菌株,引自英國(guó)皇家獸醫(yī)學(xué)院,現(xiàn)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心保藏,多殺性巴氏桿菌分離菌株43株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心保藏具體信息見(jiàn)表3;支氣管敗血波氏桿菌CVCC3000、胸膜肺炎放線桿菌CVCC259、大腸埃希菌CVCC195由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心保藏。

1.2 菌株培養(yǎng) 將凍干保存的多殺性巴氏桿菌用適量馬丁湯溶解,接種改良馬丁瓊脂斜面,37℃過(guò)夜培養(yǎng),取斜面培養(yǎng)物劃線接種改良馬丁瓊脂平板(含4%馬血清和0.1%血紅素)、普通瓊脂平板以及麥康凱瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24 h;支氣管敗血波氏桿菌和大腸桿菌是用適量的營(yíng)養(yǎng)肉湯溶解凍干菌株,接種普通瓊脂斜面,37℃過(guò)夜培養(yǎng),取斜面培養(yǎng)物劃線接種普通瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24 h;胸膜肺炎放線桿菌是用適量添加0.02%輔酶I(NAD)、8%滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)溶解凍干菌株,接種添加0.02%輔酶Ⅰ(NAD)、8%滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)斜面,37℃過(guò)夜培養(yǎng),取斜面培養(yǎng)物劃線接種添加0.02%輔酶Ⅰ(NAD)、8%滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板。分別取多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)物涂片、革蘭染色。單菌落直接作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行菌落PCR。

1.3 Biolog鑒定 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[4]。

1.4 間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[1]。

1.5 PCR引物合成 參考文獻(xiàn)報(bào)道的引物序列[2-3],由上海Invitrogen公司合成。將各引物濃度稀釋至 25 μ mol/L置-20℃保存?zhèn)溆?。引物的序列?KMTF:ATCCGCTATT TACCCAGTGG,KMTR:GCTGTAAACGAACTCGCCAC,AF:TG CCAAAATCGCAGTCAG,AR:TTGCCATCAT T GTCAGTG,BF:CAT TTATCCAAGCTCCACC,BR:GCCCGAGAGT T TCAATCC,DF:TTACAA AAGAAAGACTAGGAGCCC,DR:CATCTACCC ACTCAACCATATCAG,EF:TCCGCAGAAAAT TATTGACTC,ER:GCT TGCTGCTTGAT T TTG TG,FF:AATCGGAGAACGCAGAAATCAG,FR:T TCCGCCGTCAATTACTCTG。

1.6 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為 50μL,依次加入 10×PCR 緩沖液(含25 mmol/L MgCl2)5μL、6對(duì)引物(25 μ mol/L)各 1μL 、dNTP(2.5 μ mol/L)4μL 、Taq 酶(5 U/μ L)1μL 、雙蒸水 28μL,用滅菌槍頭挑取平板上的單個(gè)菌落,懸浮于各PCR反應(yīng)液中。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸 1 min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 特異性檢測(cè) 利用以上方法分別對(duì)支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌進(jìn)行多重PCR,以檢測(cè)其特異性。

1.8 多重PCR的初步應(yīng)用 將本所保存的48株多殺性巴氏桿菌分別進(jìn)行菌株培養(yǎng)、菌落多重PCR,并與Biolog細(xì)菌快速鑒定系統(tǒng)和間接血凝試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 多殺性巴氏桿菌的菌體形態(tài)和培養(yǎng)特性 48株多殺性巴氏桿菌分離株與參考菌株在添加血紅素和血清的改良馬丁瓊脂平板上生長(zhǎng)良好,菌落為中等大小、淡灰白色、圓潤(rùn)、光滑、邊緣整齊、閃光的露珠狀小菌落;在麥康凱瓊脂平板上不生長(zhǎng);在普通瓊脂平板上生長(zhǎng)貧瘠。顯微鏡下可見(jiàn)各菌株均為革蘭陰性球桿菌。

2.2 Biolog鑒定結(jié)果 Biolog鑒定中相似性(SIM)和位距(DIS)是2個(gè)重要的參數(shù),表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)數(shù)據(jù)的匹配程度。當(dāng)SIM＞0.75,DIS＜5.0時(shí),為良好的匹配;SIM 值越接近于1,鑒定結(jié)果的可靠性越強(qiáng)。通常在SIM值大于0.5時(shí),就可以確定菌株的分類(lèi)地位。結(jié)果48株菌株SIM值均大于0.5,85%菌株DIS小于5,這表明48株菌株均為多殺性巴氏桿菌(表略)。

2.3 間接血凝試驗(yàn)結(jié)果 各菌株間接血凝試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。共進(jìn)行了43株多殺性巴氏桿菌的間接血凝試驗(yàn),結(jié)果10株豬源多殺性巴氏桿菌5株為B型,3株為A型,2株為D型;15株禽源菌株均為A型;5株牛源和2株羊源菌株均為B型;2株馬源菌株1株為A型,1株為B型;3株兔源菌株2株為D型,1株為A型(結(jié)果見(jiàn)表1)。

2.4 定型參考菌株多重PCR結(jié)果 如圖1所示,5株定型參考菌株均擴(kuò)增出了約460 bp的DNA片段 ,同時(shí) CVCC390、391、392 、393、395 菌株還分別擴(kuò)增出約 1044 bp 、760 bp、657 bp、511 bp、851 bp的DNA片段。此多重PCR結(jié)果表明,這5株定型參考菌株均為多殺性巴氏桿菌,CVCC390菌株為A型,CVCC391菌株為B型,CVCC392菌株為D型,CVCC393菌株為E型,CVCC395菌株為F型。而用此方法對(duì)支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌進(jìn)行多重PCR,結(jié)果均未擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段。

圖1 定型參考菌株多重PCR結(jié)果

2.5 多重PCR的初步應(yīng)用 如表1所示,利用此多重PCR方法對(duì)42株多殺性巴氏桿菌分離菌株進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果所有菌株均擴(kuò)增出了種特異片段,23株菌株擴(kuò)增出了A型菌的特異片段,14株菌株擴(kuò)增出了B型菌的特異片段,5株菌株擴(kuò)增出了D型菌的特異片段(電泳圖略)。

2.6 多重PCR與間接血凝試驗(yàn)以及Biolog結(jié)果的比較 此多重PCR方法同時(shí)可以進(jìn)行種和莢膜型的鑒定,本研究利用此多重PCR方法對(duì)47株多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了種和莢膜型的鑒定,結(jié)果47株菌株均擴(kuò)增出了相應(yīng)的種特異性片段,此結(jié)果與Biolog鑒定結(jié)果完全一致,二者符合率為100%(CVCC477菌株未進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增)。同時(shí)各菌株利用此多重PCR方法分別擴(kuò)增出了相應(yīng)的莢膜型特異性片段(結(jié)果見(jiàn)表1),這與間接血凝試驗(yàn)結(jié)果完全一致,二者符合率為100%。

3 討論

多殺性巴氏桿菌廣泛分布于世界各地,可感染多種家畜、家禽、野生動(dòng)物和野禽,引起發(fā)病或死亡,對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展危害嚴(yán)重。目前,被國(guó)內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的血清學(xué)鑒定方法有2種,其一是Carter G R根據(jù)莢膜抗原的不同,將多殺性巴氏桿菌分為A、B、D、E、F等5個(gè)血清群[1];其二是 Heddleston K L根據(jù)耐熱抗原的不同將多殺性巴氏桿菌分為1、2、3……16等16個(gè)血清型[5]。這些方法均存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,敏感性較低等缺點(diǎn)。因此,建立特異敏感的PCR分型診斷方法是非常必要的。本研究利用6對(duì)特異引物建立了多殺性巴氏桿菌A、B、D、E、F 5型菌株和種特異的菌落多重PCR方法,并對(duì)42株多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了鑒定,同時(shí)與Carter G R間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行比對(duì),結(jié)果豬源菌株5株為B型,3株為A型,2株為D型;禽源菌株均為A型;牛羊源菌株均為B型;馬源菌株1株為A型,1株為B型;兔源菌株2株為D型,1株為A型。這與吳范庚等的報(bào)道一致[6]。同時(shí)此多重PCR方法與Carter G R間接血凝試驗(yàn)結(jié)果二者符合率為100%。

本研究中所用的Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)主要是根據(jù)細(xì)菌對(duì)糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等碳源的利用情況進(jìn)行鑒定。其與傳統(tǒng)鑒定方法相比具有操作簡(jiǎn)便、快速、鑒定范圍廣的特點(diǎn)。Biolog的數(shù)據(jù)庫(kù)包括細(xì)菌、酵母和絲狀真菌在內(nèi)近2000種微生物,囊括了動(dòng)植物病源細(xì)菌400多種。目前本方法已成為本中心細(xì)菌鑒定常規(guī)方法[7]。本研究利用此方法和多重PCR方法進(jìn)行比對(duì),結(jié)果二者符合率為100%。

[1]Cater G R.Studies on Pasteurella multocida.I.A hemagglutination test for the identification of serological types[J].Am T Vet Res,1955,16:481-484.

[2]Townsend K M,Boyce J D,Chung J Y,et al.Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,39(3):924-929.

[3]T ownsend K M,Boyce J D,Frost A J,et al.Development of PCR assays for species-and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].Journal of Clinical Microbiology,1998,36(4):1096-1100.

[4]Biolog.MicroLogTM System Release 4.2 User Guide[M].Hayward:CA,2001.

[5]Heddleston K L,Gallagher J E,Rebers P A.Fowl cholera:gel diffusion precipitin test fo r serotyping Pasteurella multocida from avian species[J].Avian Dis,1972,16:925-936.

[6]吳范庚.我國(guó)多殺性巴氏桿菌血清型綜述[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,1993,19(1):50-52.

[7]杜昕波,趙耘,李偉杰,等.利用BIOLOG系統(tǒng)對(duì)不同種類(lèi)細(xì)菌鑒定的研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2008,42(9):31-33.