韓彬彬,馮藝

神經(jīng)冷凍術(shù)(cryoanalgesia)是一種簡(jiǎn)便易行且有效的鎮(zhèn)痛方法,目前仍被廣泛用于臨床治療急性疼痛(如術(shù)后鎮(zhèn)痛)和慢性疼痛。但有研究表明,神經(jīng)冷凍會(huì)產(chǎn)生慢性神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NP),限制了它的推廣[1-3]。我們的一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究表明,肋間神經(jīng)冷凍鎮(zhèn)痛增加術(shù)后痛覺(jué)過(guò)敏的程度,增加觸誘發(fā)痛的發(fā)生率[4]。神經(jīng)冷凍鎮(zhèn)痛可能導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛這一現(xiàn)象已經(jīng)引起臨床醫(yī)師們的關(guān)注,但發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。1994年Deleo等成功建立大鼠坐骨神經(jīng)冷凍(sciatic cryoneurolysis,SCN)致神NP模型[5],為后來(lái)的試驗(yàn)研究提供了條件。環(huán)氧化酶(COX)是前列腺素合成的重要限速酶,它有兩種主要存在形式:COX-1和COX-2,有研究發(fā)現(xiàn)在NP模型動(dòng)物脊髓中環(huán)氧化酶表達(dá)上調(diào),推測(cè)它對(duì)NP中樞敏化有重要作用。本研究旨在通過(guò)建立大鼠SCN致NP模型,動(dòng)態(tài)觀察大鼠疼痛行為學(xué)變化和脊髓水平的COX-1的表達(dá),進(jìn)一步探討外周神經(jīng)冷凍致NP的發(fā)病機(jī)制及環(huán)氧化酶在其中的作用,為完善冷凍鎮(zhèn)痛技術(shù),指導(dǎo)未來(lái)臨床預(yù)防和治療在神經(jīng)冷凍治療疼痛過(guò)程中引發(fā)的慢性疼痛提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 模型制備[5]72只健康SD大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供),體重180～200 g,于北京大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))預(yù)檢3 d,動(dòng)物飼養(yǎng)室有良好的通風(fēng)和空氣過(guò)濾系統(tǒng),室溫維持在23℃左右,濕度55%左右,自由攝食水。大鼠經(jīng)水合氯醛(北京大學(xué)人民醫(yī)院配制)按300 mg/kg腹腔注射麻醉后,在大鼠右側(cè)下肢外側(cè)局部皮膚備皮、消毒,在股骨大轉(zhuǎn)子至膝關(guān)節(jié)沿線切皮約1.5 cm,從股二頭肌間隙鈍性分離出坐骨神經(jīng)主干,使用絲線將距離分支前2 mm的坐骨神經(jīng)主干略微提起但不超過(guò)皮面,用直徑為1.8 mm的冷凍探頭(北京庫(kù)蘭醫(yī)療設(shè)備有限公司,使用CO2作為低溫氣源,冷凍溫度達(dá)-50℃)冷凍60 s。冷凍操作后,用0號(hào)絲線逐層縫合肌筋膜、淺筋膜和皮膚。整個(gè)過(guò)程持續(xù)約10 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(N組,n=6),假手術(shù)組(S組,n=33)和冷凍手術(shù)組(C組,n=33)。假手術(shù)組暴露坐骨神經(jīng)后,僅用絲線將坐骨神經(jīng)提起,使?fàn)坷潭扰c冷凍手術(shù)組相同,持續(xù)60 s,不作冷凍操作,其余均同冷凍手術(shù)組。正常對(duì)照組未予任何處理。

1.3 疼痛行為學(xué)觀察和評(píng)分 在制模前及制模后1、2和4周測(cè)量體重,測(cè)定機(jī)械痛閾,記錄自噬評(píng)分,并觀察大鼠下肢在安靜和行走時(shí)是否正常。所有測(cè)定均在固定時(shí)間和安靜的環(huán)境下進(jìn)行。

機(jī)械痛閾的測(cè)定:將大鼠置于相互隔開(kāi)的透明有機(jī)玻璃容器內(nèi),預(yù)適應(yīng)15 min,采用8根不同質(zhì)量(1 g 、2 g 、4 g 、6 g 、8 g 、15 g 、26 g 、60 g)的 Von Frey hairs纖維絲(Stoeling Co.,Wood Dale,IL,USA)垂直刺激后足底部,彎曲至90°,持續(xù)6～8 s,大鼠在刺激時(shí)或之后即刻出現(xiàn)抬后足,延遲放落,抖動(dòng),舔食該足等均認(rèn)為陽(yáng)性,最后應(yīng)用Dixon報(bào)道的 up and down方法[6]推算出大鼠50%機(jī)械縮足閾。

如果痛閾較制模前下降≥2個(gè)級(jí)別(相鄰2根纖維絲的質(zhì)量范圍為1個(gè)級(jí)別),認(rèn)為出現(xiàn)了痛覺(jué)過(guò)敏。

采用Wall報(bào)道的方法進(jìn)行自噬評(píng)分[7]:當(dāng)后爪有血跡或皮膚破損記1分,另外任何一個(gè)腳趾的近段或遠(yuǎn)端被咬破時(shí)再記1分,最高為11分。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 各時(shí)間點(diǎn)C組、S組各取6只大鼠腰膨大脊髓,采用免疫組化方法檢測(cè)COX-1的表達(dá)。大鼠在麻醉后(同前),開(kāi)胸經(jīng)左心室插管進(jìn)入主動(dòng)脈根部,剪開(kāi)右心耳,灌注4℃生理鹽水200 ml沖盡血液,然后采用4%多聚甲醛200 ml灌注固定1 h。取腰膨大脊髓,浸入4%多聚甲醛后固定6 h,20%蔗糖脫水24 h,保存于4℃30%蔗糖中。取脊髓節(jié)段,在冷凍切片機(jī)中進(jìn)行冠狀面冰凍切片,片厚 10 μ m。3%H2O2孵育10 min;羊血清室溫孵育 10 min;滴加按 1∶200稀釋的兔抗 COX-1抗體(Cayman,MI,USA),4℃過(guò)夜;滴加羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育20 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照以PBS代替一抗,余步驟相同。于光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察,以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為COX-1免疫組化染色陽(yáng)性。在脊髓背角淺層,于400×高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野,應(yīng)用Leica圖像分析軟件分析每個(gè)視野平均灰度值和陽(yáng)性面積,以兩者的乘積的平均值代表每只大鼠脊髓COX-1表達(dá)強(qiáng)弱。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)病理性疼痛模型的建立 大鼠SCN后患側(cè)下肢運(yùn)動(dòng)障礙,表現(xiàn)為特異行為:蘇醒后患肢足背著地屈指保護(hù)位,腳掌不能著地行走,輕微水腫,隨后患肢較對(duì)側(cè)萎縮變細(xì),2周時(shí)逐漸恢復(fù)正常形態(tài)和運(yùn)動(dòng)功能,幾乎接近正常。C組和S組大鼠體重增長(zhǎng)與N組無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。

術(shù)后1周患側(cè)機(jī)械性縮足閾明顯升高,高于基礎(chǔ)值和其他兩組,2周時(shí)降至基礎(chǔ)水平,4周時(shí)再下降,低于基礎(chǔ)值和正常對(duì)照組;術(shù)后1周、2周和4周對(duì)側(cè)下肢機(jī)械性縮足閾均低于基礎(chǔ)值和正常對(duì)照組。S組雙側(cè)下肢機(jī)械性縮足閾術(shù)后1周、2周和4周均下降低于基礎(chǔ)值,而且對(duì)側(cè)低于正常對(duì)照組。見(jiàn)表2。

C組術(shù)后2周及4周痛覺(jué)過(guò)敏發(fā)生率為48%和38%,高于S組33%和19%,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,患側(cè)和對(duì)側(cè)痛覺(jué)過(guò)敏發(fā)生率無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表3。

自噬后足現(xiàn)象僅發(fā)生在C組,自噬評(píng)分高于S組。見(jiàn)表4。

術(shù)后1周發(fā)生率為40%,2周時(shí)新增3.8%,4周時(shí)新增5%。

2.2 脊髓COX-1蛋白表達(dá) 冷凍后2周和4周冷凍手術(shù)組脊髓背角淺層COX-1表達(dá)上調(diào),高于S組,且雙側(cè)脊髓COX-1表達(dá)無(wú)差異。見(jiàn)表5。

形態(tài)上觀察,表達(dá)COX-1的細(xì)胞主要為灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞和少量散在分布于白質(zhì)內(nèi)的大個(gè)細(xì)胞,經(jīng)免疫熒光共染證實(shí)分別為神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞。脊髓背角神經(jīng)元胞體小,數(shù)量多,呈游魚(yú)樣分布,腹角內(nèi)神經(jīng)元胞體大,數(shù)量少,神經(jīng)元細(xì)胞核表達(dá)為主,可見(jiàn)核內(nèi)密集的陽(yáng)性顆粒;而在白質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)有明顯的COX-1表達(dá)。

表1 正常對(duì)照組、S組和 C組大鼠體重較基礎(chǔ)值增長(zhǎng)的比較

表2 N組,S組和C組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)大鼠雙側(cè)下肢50%機(jī)械縮足閾(g)

表3 S組和C組術(shù)后大鼠痛覺(jué)過(guò)敏發(fā)生率的比較[n(%)]

表4 S組和C組術(shù)后大鼠雙側(cè)后足自噬評(píng)分比較

表5 S組和C組術(shù)后腰段脊髓背角淺層COX-1表達(dá)強(qiáng)弱比較(n=6)

3 討論

大鼠坐骨神經(jīng)冷凍是研究人類外周神經(jīng)冷凍鎮(zhèn)痛致NP的良好動(dòng)物模型。Deleo等 1994年的研究顯示,大鼠SCN后雙側(cè)下肢在術(shù)后2至3周開(kāi)始出現(xiàn)觸誘發(fā)痛,持續(xù)到術(shù)后10周[8]。這與我們的研究結(jié)果一致。大鼠冷凍側(cè)下肢先麻痹,2周時(shí)縮足閾和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)到術(shù)前水平,4周出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏,而對(duì)側(cè)1周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,一側(cè)SCN致雙側(cè)下肢發(fā)生觸誘發(fā)痛這種鏡像現(xiàn)象提示我們中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏化或去抑制可能參與NP的形成,另外痛覺(jué)過(guò)敏延遲發(fā)生也進(jìn)一步證明外周神經(jīng)局部損傷后,可能局部產(chǎn)生炎性介質(zhì)或神經(jīng)遞質(zhì)逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至中樞,引起中樞敏化或去抑制這一過(guò)程,中樞重塑是觸誘發(fā)痛延遲出現(xiàn)并持續(xù)數(shù)周的基礎(chǔ)。Deleo等1999年的研究發(fā)現(xiàn),大鼠脊神經(jīng)冷凍后7 d,雙側(cè)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活,表明冷凍確實(shí)引起中樞重塑,進(jìn)而中樞敏化,產(chǎn)生持久的觸誘發(fā)痛[9]。

大鼠自噬后足的行為是NP的特點(diǎn),外周神經(jīng)切斷和慢性壓迫均產(chǎn)生自噬現(xiàn)象。Wall等認(rèn)為完全性切斷神經(jīng)自噬率最高[7],Selter和Kim等的研究中脊神經(jīng)結(jié)扎和坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型沒(méi)有自噬行為發(fā)生[10-11]。本研究中自噬僅發(fā)生在冷凍側(cè)后足,術(shù)后1周發(fā)生率高達(dá) 40%,低于 Deleo等的研究結(jié)果76%[1]。自噬的相關(guān)機(jī)制還不清楚。Deleo等1995年研究大鼠坐骨神經(jīng)冷凍后局部神經(jīng)的病理學(xué)表現(xiàn),發(fā)現(xiàn)冷凍后1周,巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)最多,神經(jīng)纖維Wallerian變性最嚴(yán)重,小纖維開(kāi)始再生,自噬發(fā)生與纖維再生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)[12]?？梢酝茰y(cè)外周神經(jīng)損傷后,在修復(fù)過(guò)程中再生纖維異常放電或炎性介質(zhì)逆?zhèn)髦林袠?興奮中樞,引起患肢感覺(jué)異常而出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。這可以解釋自噬為什么不是在冷凍后很快發(fā)生,而往往在三四天后開(kāi)始出現(xiàn),術(shù)后一二周自噬最嚴(yán)重,這正是感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能開(kāi)始恢復(fù)的時(shí)間。

COX-2在炎性疼痛、癌性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持中起重要作用。很多研究已證明COX-1和COX-2在脊髓中均有基礎(chǔ)表達(dá),而且多種神經(jīng)病理性疼痛模型中以及臨床實(shí)踐中給予COX-2抑制劑不能緩解疼痛。這可能是COX-1在脊髓表達(dá)上調(diào)從而發(fā)揮作用。通過(guò)對(duì)基因敲除小鼠的研究表明,在疼痛中發(fā)揮作用的環(huán)氧化酶是COX-1,而不是COX-2。在手術(shù)切口和外周神經(jīng)損傷后,脊髓COX-1表達(dá)上調(diào),給予COX-1抑制劑能劑量依賴性減輕觸誘發(fā)痛[13-15]。本預(yù)試驗(yàn)表明,大鼠坐骨神經(jīng)冷凍后脊髓COX-2表達(dá)無(wú)明顯改變,而COX-1表達(dá)上調(diào)了。采用免疫組化的方法確定脊髓中COX-1的表達(dá),冷凍后2周和4周雙側(cè)脊髓背角淺層COX-1表達(dá)上調(diào)。這與雙側(cè)觸誘發(fā)痛的時(shí)間一致。因此,脊髓COX-1表達(dá)參與大鼠SCN后NP的維持。Zhang在大鼠炎性疼痛模型中發(fā)現(xiàn),脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化,表達(dá)COX-1增加[16];Deleo在坐骨神經(jīng)冷凍模型中也發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化,以星形膠質(zhì)細(xì)胞更明顯[9]。本研究顯示,從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上看脊髓中的COX-1主要由灰質(zhì)神經(jīng)元和白質(zhì)小形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。這與Deleo的研究結(jié)果一致,即坐骨神經(jīng)冷凍后脊髓小形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化,表達(dá)COX-1增加。

綜上所述,大鼠SCN模型成功地模擬了臨床中外周神經(jīng)冷凍先鎮(zhèn)痛后致痛這一病理過(guò)程,為NP的發(fā)病機(jī)制和治療的研究提供了理論基礎(chǔ)。COX-1在冷凍致NP的維持中起重要作用,提示非選擇性環(huán)氧化酶抑制劑或選擇性COX-1抑制劑可能對(duì)緩解冷凍后NP有作用。

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