江 飆，鄭佳琳，鄺貞結(jié)，梁紅茹，徐 蕙，郭霄峰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510640)

狂犬病病毒(Rabies virus，RV)是一種能引起人和動(dòng)物高度致死性的嗜神經(jīng)病毒，屬彈狀病毒科狂犬病毒屬，基因組從3'端至5'端依次排列5種結(jié)構(gòu)蛋白，即核蛋白(N)、基質(zhì)蛋白(M)、磷酸蛋白(P)、糖蛋白(G)和轉(zhuǎn)錄酶蛋白(L)[1]。其中M為RV最小的結(jié)構(gòu)蛋白，共202個(gè)氨基酸，占病毒總蛋白的11%。M蛋白能夠連接核衣殼和病毒膜，在1位～72位氨基酸殘基之間存在一個(gè)抗原決定簇，該部位與RV的免疫反應(yīng)有關(guān)。另外，由于糖蛋白的羧基端插入其中，因此它可以直接影響糖蛋白在病毒包膜表面的構(gòu)型，在病毒形態(tài)形成中都起著重要作用[2]，并且平衡、調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制[3]。

本研究通過PCR擴(kuò)增和定向克隆方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，利用大腸桿菌表達(dá)出帶有6×His標(biāo)簽的RV基質(zhì)蛋白，為狂犬病診斷方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、載體及主要試劑 pHEP-3.0(含有RV的HEP-Flury株全基因序列)由日本國立傳染病研究所Morimoto教授惠贈(zèng)。原核表達(dá)載體pQE30、鼠抗RV多克隆抗體、E.coilJM109和M15(pREP4)為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。凝膠回收試劑盒、鼠抗His單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG購自天根生化科技(北京)有限公司。pMD18-T載體、T4 DNA連接酶、KpnⅠ、HindⅢ為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。KOD plus DNA聚合酶為東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品，Prestained Protein Ladder為Fermentas公司產(chǎn)品。His-Trap FF crude購自GE公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)HEP-Flury全基因序列(AB085828)，設(shè)計(jì)了1對引物，RV-M1(5'-GGGGT ACCATGAACTTTCTATGTA-3')和RV-M2(5'-CCCA AGCTTTTATTCTAAAAGCAGAG-3')。上下游分別引入KpnⅠ與HindⅢ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的DNA片段長度為626 bp，涵蓋了M基因完整的ORF。

1.3 pQE-M重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以HEP-Flury株全長基因組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出M的ORF片段，PCR條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，克隆至pMD18-T載體，篩選陽性克隆并對其進(jìn)行序列測定。鑒定正確的克隆雙酶切，定向克隆至pQE30表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coilJM109，并用PCR和酶切和測序方法對插入片段進(jìn)行鑒定。

1.4 重組基質(zhì)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將重組質(zhì)粒pQE-M轉(zhuǎn)化至E.coliM15(pREP4)，挑取單個(gè)菌落擴(kuò)增后采用不同的IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)前OD600nm值、培養(yǎng)基抗生素濃度等進(jìn)行條件優(yōu)化。同時(shí)設(shè)立含pQE30空載體及未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌作為對照。重組蛋白按試劑使用說明采用鼠抗His單克隆抗體、鼠抗RV多克隆抗體和HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG進(jìn)行western blot鑒定。

1.5 重組基質(zhì)蛋白的分離與純化 取菌液以1∶100的體積比采用優(yōu)化的表達(dá)條件進(jìn)行大量表達(dá)，收獲菌體后用含8 mol/L尿素的磷酸鹽緩沖液懸浮菌體沉淀并超聲破碎，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清過HisTrap FF crude柱。蛋白與柱內(nèi)Ni2+充分結(jié)合后，用含20 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液洗去雜蛋白，用含500 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫目的蛋白，收集，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，并用紫外分光光度計(jì)測定純化蛋白的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 pQE-M重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用RV-M1、RV-M2引物對M基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出約600 bp的DNA片段，與預(yù)期片段626 bp大小相符。與表達(dá)載體pQE30連接后對PCR陽性的克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，也獲得大小相符的片段(圖1)。

2.2 重組M蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示在約25 ku處出現(xiàn)一條新的蛋白條帶，其大小與帶有6×His標(biāo)簽的重組M蛋白一致(圖2)。凝膠薄層掃描表明，優(yōu)化條件后誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白約占菌體總蛋白的13%。

Western blot結(jié)果顯示，重組M蛋白能夠被鼠抗His單克隆抗體(圖3A)及鼠抗RV多克隆抗體(圖3B)特異性識別，而作為對照的空載體pQE30表達(dá)產(chǎn)物、未誘導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌均沒有條帶出現(xiàn)。雖然大腸桿菌在10℃～43℃范圍內(nèi)都能夠生長并合成蛋白，但研究發(fā)現(xiàn)，37℃時(shí)細(xì)菌生長活躍，合成的蛋白量高，與此同時(shí)蛋白酶活性也很高，容易造成蛋白質(zhì)的降解，因此該溫度下的環(huán)境并不利于外源蛋白的大量表達(dá)，在圖2泳道1中，37℃下表達(dá)量較高，但呈現(xiàn)明顯的彌散現(xiàn)象；低溫條件下雖然包涵體的形成能夠被抑制，可以誘導(dǎo)表達(dá)一些可溶性蛋白，但細(xì)菌生長緩慢，表達(dá)量很少[4]，在圖2泳道3中可見各條帶清晰，但表達(dá)量較低。在本研究中，經(jīng)多次優(yōu)化誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，不同的IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)前OD600nm值等條件下表達(dá)量未出現(xiàn)明顯的變化。而不同的誘導(dǎo)溫度下表達(dá)量則有較大的不同：37℃時(shí)由于溫度高，誘導(dǎo)產(chǎn)物出現(xiàn)了較大程度的降解；而28℃誘導(dǎo)表達(dá)量較高，并且沒有出現(xiàn)明顯的降解現(xiàn)象；細(xì)菌在16℃下生長緩慢，表達(dá)量很低。

作為真核生物的結(jié)構(gòu)蛋白要進(jìn)行原核表達(dá)，需要考慮到其基因中存在較多稀有密碼子，如真核生物中編碼精氨酸(Arg)的常見密碼子agg、aga，編碼亮氨酸(Leu)的常見密碼子cta等在大腸桿菌中就缺乏相應(yīng)的tRNA。有研究顯示，這些稀有密碼子大量或連續(xù)性的出現(xiàn)可能會產(chǎn)生表達(dá)量的降低等不利影響[5]。RV的M蛋白中僅編碼精氨酸的稀有密碼子就有13組，并在編碼第117位、118位氨基酸處出現(xiàn)兩組稀有密碼子連續(xù)的成簇現(xiàn)象，這也許是本研究的重組外源蛋白在大腸桿菌中未能獲得更高表達(dá)量的重要原因。圖3B中在比目的蛋白小的位置上出現(xiàn)了一條較淺的特異性條帶，其原因在于由于稀有密碼子相應(yīng)的tRNA數(shù)量稀少，其存在可大大降低蛋白質(zhì)合成的速率，甚至使蛋白合成中途停止[6]，導(dǎo)致出現(xiàn)了截短的蛋白。

RV的M蛋白在病毒的裝配及細(xì)胞表面的芽生過程中起重要作用[7]，該蛋白兩端的親水區(qū)、中心區(qū)及與病毒囊膜結(jié)合的疏水區(qū)在各毒株間高度保守[8]。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)，通過優(yōu)化表達(dá)條件后得到了帶有6×His標(biāo)簽的M蛋白并將其分離純化。狂犬病作為一種致死性的烈性人畜共患傳染病，其防治及監(jiān)控是人類控制該病的重要手段。在常見的診斷、檢測及研究中，相關(guān)抗原有未經(jīng)純化的RV顆粒、純化的RV或純化的RV結(jié)構(gòu)蛋白等，由于M蛋白在病毒形態(tài)形成、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中均起著重要的作用，因此表達(dá)的M蛋白有助于對RV進(jìn)行深入的研究。

[1]張偉，吳時(shí)友，尹燕博，等.狂犬病診斷基因芯片的建立和檢測應(yīng)用的初步研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(2)：132-135.

[2]袁慧君，王三虎，秦鄂德.狂犬病病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2004，15(6)：596-599.

[3]Finke S,Mueller-waldeck R,Conzelmann K K.Rabies virus matrix protein regulates the balance of virus transcription and replication[J].J Gen Virl,2003,84(6):1613-1621.

[4]于志鳳，張守峰，劉曄，等.狂犬病病毒核蛋白基因在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)條件的優(yōu)化及純化[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(5)：581-585.

[5]楊麗，郭萬柱，殷華平，等.偽狂犬病病毒基因組密碼子用法特點(diǎn)分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(2)：103-106.

[6]Kurland C,Gallant J.Errors of heterologous protein expression[J].Curr Opin Biotechnol,1996,7(5):489-493.

[7]Komarova A V,Rea E,Borman A M,et al.Rabies virus matrix protein interplay with eIF3,new insights into rabies virus pathogenesis[J].Nucleic Acids Res,2007,35(5):1522-1532.

[8]王衛(wèi)華，劉奇峰.狂犬病病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].山東畜牧獸醫(yī)，2009，30(3)：46-49.