熊大芾，郭 瑋，劉鐵堅(jiān)，陳 松，鄒學(xué)農(nóng)，彭新生

隨著人口的老齡化以及居民生活水平的提高，近年來我國前列腺癌的發(fā)病率有顯著增長的趨勢。前列腺癌是最易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，約70%的前列腺癌患者死于骨轉(zhuǎn)移。發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制目前尚不十分清楚，臨床上亦缺乏有效的治療手段[1-3]。部分微小RNA（microRNAs，miR）具有腫瘤抑制基因功能，其在結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、淋巴癌等中表達(dá)明顯下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[4-10]。我們研究發(fā)現(xiàn)，相較于原發(fā)腫瘤組織，前列腺骨轉(zhuǎn)移組織中的miR-145表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示其可能參與了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的病理生理過程。Sachdeva等[11]的研究表明，miR-145通過抑制c-Myc的表達(dá)起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。而建立高表達(dá)miR-145的PC-3骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系對研究其在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用至關(guān)重要?，F(xiàn)將PC-3/pMSCV-vector及PC-3/pMSCV-miR-145穩(wěn)定細(xì)胞株建立的方法與結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

前列腺癌細(xì)胞系PC-3購自ATCC；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、載體質(zhì)粒pMSCV-puro、人胚胎腎細(xì)胞293FT為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ購自New England Biolabs公司，TIANamp Genomic DNA Kit購自天根生物科技公司，膠回收試劑盒購自AXYGEN公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司，F(xiàn)-12培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購自Hyclone公司，polybrane購自Sigma-Aldrich公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine2000和RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自復(fù)能基因公司。

1.2 pMSCV-miR-145質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 載體序列分析 pMSCV-puro上有BglⅡ、EcoRⅠ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，可以利用此兩內(nèi)切酶將目的基因片段克隆至pMSCV-puro表達(dá)載體。載體結(jié)構(gòu)圖譜見圖1。

1.2.2 基因序列分析 已知miR-145的cDNA序列為 AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC（http://genome.ucsc.edu），為方便擴(kuò)增，查找出其上下游各約500 bp的序列一并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)基因信息設(shè)計(jì)以下擴(kuò)增引物：

Forward：

gccAGATCTACCGAGGAGCAGGAGGAGAA Reverse：gccGAATTCGCGTTGGGAAGTGGGTTGAG

圖1 pMSCV-puro載體結(jié)構(gòu)圖譜

1.2.3 載體的構(gòu)建 按照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書提取正常乳腺細(xì)胞的基因組DNA（細(xì)胞由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室惠贈）。將提取的基因組DNA用nuclease-free水溶解，濃度為1 μg/μl，以其為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物和pMSCV-puro質(zhì)粒用BglⅡ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切，使其5’和3’端產(chǎn)生帶有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的粘性末端。在T4 DNA連接酶作用下，使兩者在16℃下反應(yīng)過夜，形成重組質(zhì)粒；取重組質(zhì)粒3 μl轉(zhuǎn)化200 μl感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞涂于含氨芐青霉素的平板上，37℃過夜。從平板上挑取2個(gè)單克隆菌落分別命名為test1和test2接種于LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取純化重組質(zhì)粒。

1.2.4 重組質(zhì)粒的鑒定 各取重組質(zhì)粒3 μg，用BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切擴(kuò)增后行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將鑒定合格的質(zhì)粒命名為pMSCV-miR-145，并取相應(yīng)菌液送至英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，鑒定插入的堿基序列順序是否正確。

1.3 制備逆轉(zhuǎn)錄病毒pMSCV-vector和pMSCV-miR-145

1.3.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒制備 培養(yǎng)293FT細(xì)胞，種板24～48 h，待細(xì)胞貼壁率達(dá)60%時(shí)按照lipofectamine2000（invitrogen）說明書將制備好的載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。4 h后換液，細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒在293FT細(xì)胞中結(jié)合，產(chǎn)生大量病毒并釋放入培養(yǎng)基中。隔天用10 ml注射器收集含病毒的培養(yǎng)基，同時(shí)換取新鮮培養(yǎng)基到293FT的培養(yǎng)皿中；0.45 μm過濾器過濾病毒液。之后每隔3小時(shí)收集一次病毒。

1.3.2 感染細(xì)胞株 按5×105密度將PC-3細(xì)胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中（F-12+10%FBS），24 h后開始感染病毒。病毒液中以1000：1的比例加入polybrane并混勻。棄去待感染細(xì)胞的培養(yǎng)基，吸取2 ml病毒液至PC-3細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后換2 ml新病毒液繼續(xù)感染細(xì)胞，3 h后更換正常培養(yǎng)基過夜。隔天以2 ml新病毒液再次感染細(xì)胞，3 h后換回正常培養(yǎng)基。感染結(jié)束后24～48 h，加入含puromycin（0.5 μg/ml）的細(xì)胞培養(yǎng)基篩選陽性細(xì)胞，連續(xù)篩選3 d，更換正常培養(yǎng)基。

1.4 穩(wěn)定細(xì)胞株P(guān)C-3/pMSCV-vector、PC-3/pMSCV-miR-145的鑒定

1.4.1 用Trizol裂解各細(xì)胞株，提取RNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR，以檢測miR-145在PC-3/pMSCV-miR-145細(xì)胞中的表達(dá)水平。以PC-3/pMSCV-vector細(xì)胞株為空載體對照，以PC-3細(xì)胞株為空白對照，以鑒定穩(wěn)定表達(dá)miR-145的細(xì)胞株是否已成功建立。

1.4.2 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 通過Poly A Polymerase對所有miRNA的3’端進(jìn)行加“PolyA”尾處理，延長各成熟miRNA的長度以用于后續(xù)反應(yīng)；同時(shí)利用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RTase及與“Poly A”特異性結(jié)合的Oligo dT Adaptor引物對Poly A化的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。

1.4.3 根據(jù)說明書進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增 用特異性正向引物、通用反向引物和試劑盒中含SYBR Green、dNTP、DNA聚合酶及相關(guān)buffer的混合液對cDNA進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增和檢測。待檢基因miR-145的正向引物序列：GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCTA。內(nèi)參基因homosnU6的正向引物序列：CAAATTCGTGAAGCGTTCCATAT。

1.4.4 運(yùn)用The Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System進(jìn)行qRT-PCR檢測。然后得出各孔CT值并算出均值，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量。ΔΔCT=（CT試驗(yàn)組miR-145— CT對照組miR-145）—（CT試驗(yàn)組U6—CT對照組U6），此處的對照組為pMSCV-vector空載體對照組。miR-145的相對表達(dá)量RQ=2-ΔΔCT。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間整體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

由圖1可知，若目的基因插入正確，即可被BglⅡ和EcoRⅠ酶切出一條約1173 bp的DNA條帶。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體經(jīng)酶切鑒定，切出一條約1173 bp的條帶（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳結(jié)果

2.2 基因測序

測序結(jié)果如圖3，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)插入DNA片段無突變。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和藥物篩選結(jié)果

轉(zhuǎn)染24 h后重組質(zhì)粒開始表達(dá)，此時(shí)通過puromycin篩選可殺死未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。3 d后，當(dāng)空白對照組細(xì)胞全部死亡時(shí)，轉(zhuǎn)染組存活的細(xì)胞即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率約為80%～90%。熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pMSCV-miR-145實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的miR-145表達(dá)水平與pMSCV-vector空載體對照組之間相比差異達(dá)2000倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。證明在穩(wěn)定篩選出的細(xì)胞株中，miR-145的表達(dá)水平升高，穩(wěn)定株篩選成功（圖4）。

表1 各細(xì)胞株中miR-145的表達(dá)差異

圖3 pMSCV-miR-145的測序圖

圖4 qRT-PCR鑒定miR-145在各細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)水平

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤治療的瓶頸。骨轉(zhuǎn)移是前列腺癌晚期的主要表現(xiàn)，無論采用何種治療方法，患者的生存期僅能維持2～3年。明確前列腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的機(jī)制可以為疾病的預(yù)防和靶向性治療提供新的思路和依據(jù)，因此眾多學(xué)者致力于這方面的研究。近期報(bào)道顯示，上調(diào)或抑制miRNA的表達(dá)可能是延緩腫瘤病灶轉(zhuǎn)移的有效手段，但目前針對miRNA與腫瘤骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究報(bào)道甚少，其在骨轉(zhuǎn)移過程中的變化及其作用尚未明確[12-14]。

miRNA是一類新的高度保守的、非編碼的小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)不完全性互補(bǔ)配對，對基因表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用或產(chǎn)生基因沉默。雖然在表達(dá)基因中僅占很小一部分，但作為一種新的廣泛存在的基因表達(dá)調(diào)節(jié)分子，miRNA可以通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、生存、運(yùn)動和形態(tài)發(fā)生等在生物體的生長、發(fā)育、衰老及死亡的調(diào)控過程中扮演重要角色[4]，是機(jī)體發(fā)育和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用[4-15]。在前列腺癌轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞系LNCaP中，miR-145的異常表達(dá)可引起細(xì)胞的增殖抑制；對LNCaP細(xì)胞系進(jìn)行miR-145轉(zhuǎn)染后，最大可達(dá)到100%的生長抑制[10]。LNCaP來源于前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，miR-145可以影響前列腺癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞的生長，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-145的表達(dá)水平與前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)，但與其轉(zhuǎn)移是否存在直接聯(lián)系，目前尚無定論；在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3和腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系DU145中，miR-145通過抑制BNIP3的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是否跟腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)也尚未得到證實(shí)[16]。故miRNA、靶蛋白和腫瘤轉(zhuǎn)移三者之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。因此，從研究miRNA入手，闡明miRNA與骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其參與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，可為進(jìn)一步探索從根本上預(yù)防和治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的方法提供理論依據(jù)。而要達(dá)到這一目標(biāo)，首先需要解決的問題是獲得穩(wěn)定高表達(dá)miR-145的腫瘤細(xì)胞株。

目前在細(xì)胞中過表達(dá)miRNA的常用方法有3種：（1）化學(xué)合成制備目的miRNA，通過轉(zhuǎn)染介質(zhì)如陽離子脂質(zhì)體將目的miRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)；（2）miRNA表達(dá)質(zhì)粒載體；（3）病毒載體[11]。前一種為瞬時(shí)表達(dá)，后兩種為穩(wěn)定表達(dá)?；瘜W(xué)合成miRNA加脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法適用范圍較廣，目的序列明確，無需考慮克隆載體的突變和加工的效率問題，量可控制，可以研究濃度依靠性效應(yīng)；此外，化學(xué)合成的這種小RNA分子轉(zhuǎn)染方便，不會對細(xì)胞造成毒性效應(yīng)。但因其僅為瞬時(shí)表達(dá)，故只能用以研究一段時(shí)間內(nèi)的靶基因表達(dá)水平，不能獲得穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系來進(jìn)行長時(shí)間的研究，重復(fù)性較差。體內(nèi)表達(dá)制備miRNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長時(shí)期的研究，特別是在帶有抗性基因的載體轉(zhuǎn)染成功后可以采用相應(yīng)的抗生素進(jìn)行篩選，從而使miRNA在細(xì)胞中能夠持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)。病毒載體用于miRNA表達(dá)的優(yōu)勢在于可以高效率地直接感染細(xì)胞，部分病毒載體還可將自身基因和目的基因整合在宿主細(xì)胞的基因組中，使之隨宿主細(xì)胞基因的表達(dá)而大量表達(dá)[17]。以往研究中多采用重組腺病毒，但因其屬于DNA病毒，所攜帶的目的基因仍難以整合到宿主細(xì)胞的DNA中（僅為0.001%～1%），且無法傳到子代并獲得穩(wěn)定的表達(dá)[18]。作為一種RNA病毒，本實(shí)驗(yàn)采用的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有與腺病毒同樣高效的感染細(xì)胞功能，且目的基因可隨病毒RNA一起整合到宿主的DNA中，隨細(xì)胞分裂傳至子代細(xì)胞而獲得穩(wěn)定的表達(dá)[19]。miRNA運(yùn)用病毒載體轉(zhuǎn)染可以進(jìn)行基因沉默的較長時(shí)間研究，可避免因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便，且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定，尤其適用于已知一個(gè)有效的miRNA序列且需要維持較長時(shí)間的基因沉默研究[20]。但需注意的是病毒具有一定的毒性，且病毒載體制備周期較長，費(fèi)用較高。總之，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNA干擾，可以長期穩(wěn)定地對靶基因進(jìn)行沉默，能夠解決化學(xué)合成序列-脂質(zhì)體復(fù)合物法或質(zhì)粒載體法瞬時(shí)、低效的缺點(diǎn)，拓展了RNA干擾的使用范圍，是目前國內(nèi)外研究基因功能較為先進(jìn)的技術(shù)，適用于長時(shí)間的基因功能研究[21]。

總之，我們成功建立了穩(wěn)定高表達(dá)miR-145的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，為明確miR-145在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)，為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防和靶向性治療研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Clarke NW,Hart CA,Brown MD.Molecular mechanisms of metastasis in prostate cancer[J].Asian J Androl,2009,11(1):57-67.

2 Roodman GD.Mechanisms of bone metastasis[J].N Engl J Med,2004,350(16):1655-1664.

3 Mundy GR.Metastasis to bone:causes,consequences and therapeutic opportunities[J].Nat Rev Cancer,2002,2(8):584-593.

4 Wu W,Sun M,Zou GM,et al.MicroRNA and cancer:Current status and prospective[J].Int J Cancer,2007,120(5):953-960.

5 Wang CJ,Zhou ZG,Wang L,et al.Clinicopathological significance of microRNA-31,-143 and-145 expression in colorectal cancer[J].Dis Markers,2009,26(1):27-34.

6 Porkka KP,Pfeiffer MJ,Waltering KK,et al.MicroRNA expression profiling in prostate cancer[J].Cancer Res,2007,67(13):6130-6135.

7 Ambs S,Prueitt RL,Yi M,et al.Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer[J].Cancer Res,2008,68(15):6162-6170.

8 OzenM,CreightonCJ,OzdemirM,etal.Widespread deregulation ofmicroRNA expression in human prostate cancer[J].Oncogene,2008,27(12):1788-1793.

9 Akao Y,Nakagawa Y,Naoe T.MicroRNAs 143 and 145 are possible common onco-microRNAs in human cancers[J].Oncol Rep,2006,16(4):845-850.

10 Tong AW,Fulgham P,Jay C,et al.MicroRNA profile analysis of human prostate cancers[J].Cancer Gene Ther,2009,16(3):206-216.

11 Sachdeva M,Zhu S,Wu F,et al.p53 represses c-Myc through induction of the tumor suppressor miR-145[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(9):3207-3212.

12 Edwards JK,Pasqualini R,Arap W,et al.MicroRNAs and ultraconserved genes as diagnostic markers and therapeutic targets in cancer and cardiovascular diseases[J].J Cardiovasc Transl Res,2010,3(3):271-279.

13 Hwang JH,Voortman J,Giovannetti E,et al.Identification of microRNA-21 as a biomarker for chemoresistance and clinical outcome following adjuvant therapy in resectable pancreatic cancer[J].PLoS One.2010,5(5):e10630.

14 Wu W.MicroRNA:potential targets for the development of novel drugs?[J]Drugs R D,2010,10(1):1-8.

15 Chen X,Gong J,Zeng H.MicroRNA145 targets BNIP3 and suppresses prostate cancer progression[J].Cancer Res,2010,70(7):2728-2738.

16 Shi Y.Mammalian RNAi for the masses[J].Trends Genet,2003,19(1):9-12.

17 Yu F,Yao H,Zhu P,et al.Let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells[J].Cell,2007,131(6):1109-1123.

18 譚媛,姚德生,李力,等.攜帶k-ras和c-Myc基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)導(dǎo)正常卵巢細(xì)胞效能的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,27(1):56-59.

19 Jia F,Zhang YZ,Liu CM.A Retrovirus-based system to stably silence hepatitis B virus genes by RNA interference[J].Biotechnol Lett,2006,28(2):1679-1685.

20 代晨,鄧文,張彥明,等.表達(dá)miR-150 shRNA細(xì)胞株的初步建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(8):1-5.

21 Cunningham AP,Andrews LG,Tollefsbol TO.Retrovirusmediated RNA interference.Targeting hTERT through stable expression of short-hairpin RNA[J].MethodsMol Biol,2007,405:39-46.