陳慶榆,孫玉軍,尹鋒

(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽(yáng) 233100)

靈芝屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬,為多孔菌科真菌赤芝[Ganoderma lucid um(Leyss.ex Fr.)Karst.]或紫芝(Ganoderma sinense Zhao Xu et Zhang)的干燥子實(shí)體[1],是我國(guó)中藥及傳統(tǒng)食療寶庫(kù)中的瑰寶。靈芝含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,其中靈芝多糖是最主要的有效成分[2]?，F(xiàn)代藥理和臨床研究證明,靈芝多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗自由基、延緩衰老等作用[3]。靈芝還具有很強(qiáng)的富硒能力,所富集的硒主要以蛋白硒、多糖硒、核酸硒等有機(jī)態(tài)硒存在。硒是人體必需的微量元素之一,參與人體許多組織的代謝,缺硒會(huì)導(dǎo)致多種疾病[4]。無(wú)機(jī)硒在體內(nèi)不易吸收且毒性強(qiáng),人體對(duì)有機(jī)硒的吸收率比無(wú)機(jī)硒高30%,毒性也小,并且可以在人體組織內(nèi)儲(chǔ)存[5]。因此利用靈芝作為富硒的載體,將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒、發(fā)揮硒和靈芝固有的生理作用,在醫(yī)藥領(lǐng)域具有很廣闊的應(yīng)用前景。

杜明[6]等對(duì)富硒靈芝子實(shí)體中的富硒蛋白進(jìn)行了研究,目前對(duì)靈芝富硒多糖的研究也較多,但主要是發(fā)酵液富硒多糖,對(duì)子實(shí)體富硒多糖的研究相對(duì)較少。本文以富硒靈芝子實(shí)體為原料提取富硒多糖,對(duì)其多糖和硒含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

富硒靈芝子實(shí)體:在普通靈芝栽培料中,添加不同量的無(wú)機(jī)硒鹽(0、50 、100、150、200、250 μg/g 栽培料),通過(guò)靈芝菌在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收、富集,然后轉(zhuǎn)化為含有機(jī)態(tài)硒的生物富硒靈芝子實(shí)體材料。

1.2 儀器

UV 756MC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);電子分析天平JA5003(上海天平儀器廠);HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠);可調(diào)試電熱爐(江蘇金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)

1.3 試劑

Dextran T10,瑞典 Pharmacia公司;鄰苯二胺(AR.)、蒽酮(AR.)、葡萄糖(AR)等,上?；瘜W(xué)試劑公司;高氯酸(AR),上海金鹿化工有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

采集富硒靈芝子實(shí)體以及普通靈芝子實(shí)體,用自來(lái)水洗凈,蒸餾水沖淋,切片,冷凍干燥粉碎制成試驗(yàn)樣品,分別編號(hào)為CK 和A 、B、C 、D、E。

2.2 樣品中硒含量的測(cè)定

2.2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]。分別取硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L 置于 125 m L 分液漏斗中,加入3 m L 0.1%鄰苯二胺溶液,用水稀釋成50 m L左右,搖勻后再用80%甲酸和濃氨水調(diào)pH為2,在暗處放置1h,用10m L甲苯萃取振蕩3 min,靜置8 min,將萃取的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)移至50 m L容量瓶中定容。用1 cm比色皿,以試劑空白為參比,在335 nm處測(cè)其吸光度。由測(cè)得的吸光度A值與Se濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 樣品中硒含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g試樣置于100 m L燒杯中,加入混合酸(HNO3∶H2SO4∶HClO4=4∶1∶1)15m L,蓋上表面皿,消化 24h,加熱冒白煙至溶液澄清時(shí),冷卻,轉(zhuǎn)移到50 m L容量瓶中定容。分取試液10.0 m L置于125 m L分液漏斗中,同上處理,測(cè)吸光度,計(jì)算其相應(yīng)含量。

2.3 樣品中多糖含量的測(cè)定

2.3.1 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8]。

將葡聚糖Dextran T10置于60℃下烘1h,再逐漸升溫至105℃,干燥至恒重。精密稱(chēng)取 0.100 g,置500m L容量瓶中,用蒸餾水溶解并定容到刻度,精密吸取5.0、10.0、15.0、25.0 、37.5 m L,分別置100m L 容量瓶中 ,用蒸餾水定容至刻度 ,分別得到 10 、20 、30 、50 、75 μg/m L的溶液。再分別取上述試液各1.0 m L,在冰水浴中加入蒽酮-硫酸試劑5.0 m L,放置,冷卻至室溫。以蒸餾水1.0m L加入蒽酮-硫酸試劑5.0 m L為空白對(duì)照,于620 nm處測(cè)定吸光度。

2.3.2 樣品中多糖的提取。靈芝樣品10g加l m L NaOH溶液l00 m L,60℃水浴中提取4h,抽濾,濾渣加lm L NaOH溶液50 m L,反復(fù)提取兩次,合并濾液,濃縮[9],Sevag法除蛋白,加入95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇,4℃靜置過(guò)夜,5000r冷凍離心15 min,沉淀冷凍干燥得靈芝硒多糖,加蒸餾水溶解,稀釋至適當(dāng)濃度,同上處理,測(cè)吸光度,計(jì)算其相應(yīng)含量。

3 結(jié)果與分析

以硒濃度為橫坐標(biāo),A335為縱坐標(biāo),繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為C=0.02135A+0.00026。

根據(jù)回歸方程,進(jìn)一步計(jì)算得樣品中的硒元素含量(見(jiàn)表1)。

以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo),A620為縱坐標(biāo),繪制糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為A=0.0091C+0.0411,R2=0.9915。根據(jù)回歸方程,進(jìn)一步計(jì)算得樣品中多糖含量(見(jiàn)表1)。

表1 富硒靈芝硒和多糖的含量

圖1 不同硒鹽濃度對(duì)富硒靈芝硒和多糖含量的影響

在培養(yǎng)基中分別添加 0、50、100、150、200、250 μg/g的硒鹽,人工栽培相應(yīng)獲得普通靈芝子實(shí)體(對(duì)照CK)以及富硒靈芝子實(shí)體A 、B、C 、D、和 E,通過(guò)分析其中硒的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):

人工栽培的普通靈芝子實(shí)體中硒的含量?jī)H為3.192 μg/g,而富硒靈芝子實(shí)體 A 、B、C、D 、E 的硒含量則分別為 28.976、54.032、79.159、86.291 和 90.405 μg/g,在培養(yǎng)基中硒濃度較低(150μg/g)時(shí),靈芝中富集的硒量隨著環(huán)境中添加硒量的增加而顯著增加,但當(dāng)達(dá)到富硒水平79.159μg/g后,靈芝子實(shí)體富集硒的能力又開(kāi)始減弱,高硒抑制了靈芝子實(shí)體對(duì)硒的進(jìn)一步吸收和生物轉(zhuǎn)化。

從表1可以看出,不同含硒量的富硒靈芝子實(shí)體中多糖的含量均高于對(duì)照普通靈芝,這說(shuō)明硒影響了靈芝子實(shí)體多糖的代謝,促進(jìn)了多糖的合成。當(dāng)硒鹽濃度150μg/g時(shí),富硒靈芝中多糖含量為11.456%達(dá)到了最大值,即靈芝在一定硒濃度范圍內(nèi)合成高含量的多糖可能是為了結(jié)合更多的硒,并與胡國(guó)元[10]在富硒金針菇菌絲多糖研究中的結(jié)論一致。但硒對(duì)靈芝多糖和硒轉(zhuǎn)化的影響并不相同,隨著培養(yǎng)基中外施硒鹽濃度的增加,富硒靈芝中有機(jī)硒的含量持續(xù)增加。但靈芝中的多糖含量在硒鹽濃度為150μg/g以上是多糖含量呈顯著下降。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在硒鹽濃度150μg/g以?xún)?nèi),靈芝子實(shí)體內(nèi)有機(jī)硒含量明顯增加,多糖含量呈上升趨勢(shì),但隨著硒鹽濃度的增大,硒富集能力相對(duì)減弱,多糖含量呈下降趨勢(shì),多糖合成受阻,進(jìn)一步證明在靈芝的富硒培養(yǎng)過(guò)程中,硒參與了多糖的合成。

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