張 娜，高 萍，王文彤，陶遵威，鄭 奪（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津市 300020）

鹽酸左氧氟沙星是第3代氟喹諾酮類抗菌藥物，具有水溶性好、活性強(qiáng)、廣譜、毒副作用低等特點(diǎn)，對(duì)細(xì)菌性結(jié)膜炎和角膜炎等眼科感染有良好的療效，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景[1]。本文選用殼聚糖和膠原蛋白為增效劑及增稠劑制備了鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液，延緩了其在眼部釋藥時(shí)間，提高了生物利用度，并參考GB/T 16886.5-2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》[2]中試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)了該滴眼液的體外細(xì)胞毒性，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》評(píng)價(jià)了其急性毒性和皮膚刺激反應(yīng)[3]，保證安全給藥的同時(shí)還為進(jìn)一步開展臨床試驗(yàn)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物

小鼠成纖維細(xì)胞（簡稱L-929細(xì)胞，中國藥品生物制品檢定所）；昆明種小白鼠，♂♀各半，體質(zhì)量17～20 g，合格證號(hào)：SCXK（京）2007-0001；大耳白兔，♂♀各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，合格證號(hào)：SCXK（京）2005-0002，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試藥

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（美國GIBCO公司）；胎牛血清和胰蛋白酶（美國Sigma公司）；高密度聚乙烯（江門市新會(huì)區(qū)浩天工貿(mào)有限公司，批號(hào)：081218）；瓊脂粉（北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：061219）；0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號(hào)：8C93B）；鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液（自制，批號(hào)：081011、081012、081013，規(guī)格：15 mg·5 mL－1）。

1.3 儀器

MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器和MCO-18AIC（UV）型CO2培養(yǎng)箱均由日本Sanyo公司提供；W-7401超凈工作臺(tái)（德國Steag公司）；TMS型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

2.1.1 樣品的制備。試驗(yàn)樣品：將0.1 mL鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液滴在直徑10 mm的8層濾紙圓片上；陰性對(duì)照：直徑為10 mm的高密度聚乙烯圓片；陽性對(duì)照：涂有鄰苯二甲酸二辛酯的直徑為10 mm的聚氯乙烯圓片；生理鹽水對(duì)照：將0.1 mL生理鹽水滴在直徑10 mm的8層濾紙圓片上。

2.1.2 操作步驟。采用瓊脂擴(kuò)散法[2]檢測(cè)細(xì)胞毒性：取正常傳代的L-929細(xì)胞10 mL，接種于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿接種細(xì)胞3×106個(gè)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入10 mL瓊脂培養(yǎng)基（3%瓊脂與2倍的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶1混合），待其凝固后，每一平皿內(nèi)放陰、陽性及生理鹽水對(duì)照各1片、試驗(yàn)樣品2片、平行操作5皿，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱再培養(yǎng)24 h，棄去所有樣品（試驗(yàn)樣品，陰、陽性及生理鹽水對(duì)照），用0.01%中性紅染色20 min后進(jìn)行結(jié)果評(píng)定。

2.1.3 評(píng)定指標(biāo)[2]。用倒置顯微鏡觀察試驗(yàn)樣品和陰、陽性及生理鹽水對(duì)照?qǐng)A片下及周圍褪色區(qū)域，并按表1所示指標(biāo)評(píng)價(jià)每一樣品的褪色指數(shù)和溶解指數(shù)，再按表2確定各組細(xì)胞毒性反應(yīng)的分級(jí)，表1、表2見下。

表1 褪色指數(shù)和溶解指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Evaluation standard of fading index and dissolving index

表2 細(xì)胞反應(yīng)分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab 2 Evaluation standard for the grade of cellular reaction

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)[3]

選小鼠20只，平均分為供試品組和空白對(duì)照組，每組10只，均采用靜脈注射方式給藥，供試品組以鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液按15 mg·kg－1給藥1次，相當(dāng)于成人臨床日用量的（成人每日鹽酸左氧氟沙星為4.5 mg，按成人體質(zhì)量60 kg計(jì)算，劑量為0.075 mg·kg－1）200倍；空白對(duì)照組給相同體積的生理鹽水。注射完畢后，觀察14 d小鼠的一般狀態(tài)和死亡數(shù)，并記錄體質(zhì)量變化。

2.3 皮膚刺激反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)步驟。選用大耳白兔12只，實(shí)驗(yàn)前24 h剪剃其背部脊柱兩側(cè)被毛備皮，去毛范圍為3 cm×3 cm，隨機(jī)分為皮膚完好組和皮膚破損組，每組6只，另在皮膚破損組兔的脊柱兩側(cè)用無菌針頭劃成“#”，以滲血為準(zhǔn)。采用同體左右側(cè)自身對(duì)照，將鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液滴到2.5 cm×2.5 cm的紗布?jí)K上，敷貼在左側(cè)背部，陰性對(duì)照將生理鹽水滴到2.5 cm×2.5 cm的紗布?jí)K上，敷貼在右側(cè)背部，用半封閉性包扎帶固定6 h，每次用量均為1.5 mg·d－1，每天1次，連續(xù)用藥7 d。末次用藥24 h后，用溫水去除殘留藥物，分別于1、24、48、72 h連續(xù)觀察并記錄涂藥部位有無紅斑及水腫等情況。

2.3.2 評(píng)定指標(biāo)。紅斑和水腫按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[3]：無紅斑0分，紅斑勉強(qiáng)可見為1分，紅斑明顯可見2分，嚴(yán)重紅斑3分，紫紅色紅斑并有焦痂形成4分；無水腫0分，水腫勉強(qiáng)可見1分，邊緣高出周圍皮膚的水腫2分，皮膚隆起約1 mm、輪廓清楚的水腫為3分，皮膚隆起1 mm以上范圍擴(kuò)大的水腫4分。平均分值＝（紅斑反應(yīng)總分+水腫反應(yīng)總分）/每組動(dòng)物數(shù)，按平均分值進(jìn)行刺激強(qiáng)度[4]評(píng)價(jià)，皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab 3 Evaluated standard of skin irritation

3 結(jié)果

3.1 體外細(xì)胞毒性

各組褪色指數(shù)和溶解指數(shù)結(jié)果詳見表4。

表4 各組細(xì)胞褪色指數(shù)和溶解指數(shù)結(jié)果Tab 4 Results of fading index and dissolving index

由表4分析可知，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、生理鹽水對(duì)照、試驗(yàn)樣品的細(xì)胞毒性反應(yīng)分別為0、2、1、1級(jí)。

3.2 急性毒性

注射后小鼠在觀察期狀況良好，活動(dòng)、食欲正常，呼吸平穩(wěn)，無驚厥、癱瘓和死亡等毒性反應(yīng)，小鼠體質(zhì)量日漸增加。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件將空白對(duì)照組和供試品組每天的體質(zhì)量進(jìn)行組間t檢驗(yàn)分析，結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠體質(zhì)量比較（g，±s，n＝10）Tab 5 Comparison of body weight of mic（eg，±s，n＝10）

表5 各組小鼠體質(zhì)量比較（g，±s，n＝10）Tab 5 Comparison of body weight of mic（eg，±s，n＝10）

空白對(duì)照組17.7±0.5 18.5±0.8 20.2±0.8 21.9±0.8 23.6±0.8 26.6±0.7 31.6±0.6時(shí)間/d 1 2 3 5 7 1 0 14供試品組17.5±0.6 18.3±1.0 19.7±1.1 21.3±1.3 22.8±1.3 25.6±1.5 30.4±1.5

由表5可知，供試品組與空白對(duì)照組小鼠在14 d內(nèi)體質(zhì)量變化沒有明顯差異，表明該滴眼液對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響。

3.3 皮膚刺激反應(yīng)

除去敷貼物后1、24、48、72 h，觀察各部位皮膚組織反應(yīng)情況，皮膚完好組兔用藥側(cè)、對(duì)照側(cè)皮膚均未發(fā)現(xiàn)紅斑及水腫，皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)均為無刺激性（平均分值為0）。破損皮膚組1、24 h時(shí)僅有1只出現(xiàn)紅斑和水腫，48 h后反應(yīng)平均分值均為0，5 d后傷口均愈合，基本恢復(fù)正常狀態(tài)，皮膚刺激評(píng)價(jià)均為無刺激性（平均分值均小于0.50），具體結(jié)果見表6。

表6 各組小鼠皮膚刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 6 Results of dermal irritation test of each group

4 討論

本課題首次將殼聚糖和膠原蛋白同時(shí)與鹽酸左氧氟沙星配方組合制備鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液。殼聚糖為甲殼類動(dòng)物中提取的天然多糖甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，殼聚糖的加入不但增加了藥液的黏度，延長了藥物在眼內(nèi)的滯留時(shí)間，增加了藥物的吸收，而且該物質(zhì)本身具有消炎、抑菌、止血等功能[4]；另外有文獻(xiàn)[5]數(shù)據(jù)表明，大、小白鼠口服殼聚糖的半數(shù)致死劑量（LD50）＞16 g·kg－1，與蔗糖相當(dāng)，長期毒性實(shí)驗(yàn)亦無明顯毒性發(fā)生，未發(fā)現(xiàn)誘變性、皮膚刺激性和過敏反應(yīng)發(fā)生。膠原蛋白是連接組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白，膠原蛋白不僅可以作為載體使藥物在眼部緩慢釋放，而且還可以促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)和細(xì)胞生長[6]，另外膠原蛋白溶液是一種無毒、無刺激、無過敏性的安全新型外用藥物[7]。殼聚糖和膠原蛋白作為新型、安全的生物材料，在眼科疾病治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。

鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液的體外細(xì)胞毒性、急性毒性和皮膚刺激反應(yīng)均符合相關(guān)國家規(guī)范和要求，本實(shí)驗(yàn)研究證明了該滴眼液用藥的安全性，為進(jìn)一步深入研究和推廣應(yīng)用提供了的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]汪榮軍.左氧氟沙星眼用凝膠的制備[J].安徽醫(yī)藥，2006，10（2）：141.

[2]GB/T16886.5-2003，中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)[S].

[3]徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：227.

[4]賴善城，盧雪梅.加替沙星殼聚糖滴眼液的制備及質(zhì)量控制[J].中國藥房，2005，16（24）：1 870.

[5]曾 健，李曉輝，黃鉞華，等.殼聚糖DCX-16的初步安全性評(píng)價(jià)[J].中國藥房，2005，16（3）：172.

[6]劉慧玲，王 棟，章金剛.膠原蛋白在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，2005，24（3）：239.

[7]馮國基，潘建明，吳曉斌，等.膠原溶液的安全性試驗(yàn)研究[J].廣東藥學(xué)，1995，5（4）：39.