劉開全，馬學(xué)萍，陸偉東，秦留云

（曲靖師范學(xué)院生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 曲靖 655011）

心葉煙(Nicotiana glutinosa)和三生煙(N.tabacumvar.SamsunNN)同為帶N基因的煙草，二者都被廣泛用作抗TMV的枯斑寄主實(shí)驗(yàn)材料。張曉燕等以三生煙為材料，用細(xì)胞的化學(xué)沉淀法測(cè)定了TMV侵染對(duì)煙草葉片細(xì)胞中Ca2+分布的影響[1]；翟梅枝等以心葉煙為材料，對(duì) 26種植物樣品進(jìn)行了抗病毒(TMV)活性測(cè)定[2]。N基因介導(dǎo)的抗TMV的一個(gè)顯著特點(diǎn)是TMV侵染后會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)，即在侵染點(diǎn)部位產(chǎn)生枯斑，且枯斑的形態(tài)、數(shù)目、大小與接種濃度有關(guān)[3]。本研究以5個(gè)濃度的TMV溶液分別接種三生煙和心葉煙，對(duì)其產(chǎn)生枯斑的形態(tài)、數(shù)目、大小等進(jìn)行分析比較，旨在初步探討心葉煙和三生煙對(duì)TMV侵染是否存在過敏性差異，為抗病品種的選育及抗病機(jī)理研究提供試驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

TMV在普通煙K326擴(kuò)繁后提純，測(cè)得其質(zhì)量濃度為0.3178 mg/mL[4]。取以上病毒液，用蒸餾水稀釋成 5個(gè)濃度分別為 1.589×10-2，3.178×10-2，4.767×10-2，6.356×10-2，7.945×10-2mg/mL 的病毒接種液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取健康8葉期心葉煙和三生煙打頂，留下3～4片真葉，培育1周后每半葉接種上述各病毒液0.10 mL，每個(gè)濃度接種兩品種各5株煙苗，共15片葉子。接種后在溫室中培育1周，比較兩個(gè)品種煙草上形成枯斑的形狀，并參照陳學(xué)平等[5]方法記錄各處理組煙葉枯斑數(shù)量及大小。試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理后，用軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 4軟件作圖。

2 結(jié) 果

心葉煙和三生煙接種病毒后形成的枯斑在形態(tài)上并無差異，其枯斑都為瓜型。隨著接種病毒質(zhì)量濃度的增加，心葉煙和三生煙產(chǎn)生的枯斑數(shù)也隨之增加；在同一個(gè)濃度下，心葉煙產(chǎn)生的全葉平均枯斑數(shù)明顯多于三生煙（表1）。二因素方差分析（two-ways ANOVA）表明，兩品種間有極顯著差異（p＜0.01），各處理濃度之間也有極顯著差異（p＜0.01）。心葉煙接種病毒后產(chǎn)生的枯斑數(shù)與處理濃度顯著相關(guān)（r=0.958，p=0.010＜0.05），三生煙接種病毒后產(chǎn)生的枯斑數(shù)與處理濃度之間相關(guān)性不強(qiáng)（r=0.867，p=0.057）。

表1 兩種煙草接種5個(gè)濃度的TMV后形成的全葉平均枯斑數(shù)Table 1 Mean of localized necrotic lesions on the leaf of two tobacco varieties in five treatments

兩種煙草產(chǎn)生的大中小三種枯斑[4]數(shù)目（表2）和比例（數(shù)據(jù)表未列出）相差較大，心葉煙的中等枯斑占70%～80%，小枯斑都少于10%，大枯斑多數(shù)占 15%～20%；而三生煙中等枯斑只占 50%～70%，小枯斑多數(shù)占 25%～40%，大枯斑多數(shù)少于15%。分別用各濃度下兩個(gè)品種的大中小枯斑平均數(shù)做獨(dú)立性檢驗(yàn)（R×C列聯(lián)表），以及5個(gè)濃度合并后兩品種的3種枯斑數(shù)做獨(dú)立性檢驗(yàn)，結(jié)果表明（表3），除1.589×10-2mg/mL濃度外，兩品種間的3種枯斑數(shù)都有顯著差異（p＜0.01）。

表2 兩種煙草接種不同濃度病毒后形成的小、中和大枯斑全葉平均數(shù)Table 2 Mean of small,middle and large localized necrotic lesions on the leaf of two tobacco varieties inoculated TMV in five concentration

表3 兩種煙草小、中和大枯斑全葉平均數(shù)的獨(dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of Chi-Square Tests of two tobacco varieties (depend on the mean of small,middle and large localized necrotic lesions on the leaf )

兩種煙草接種不同質(zhì)量濃度病毒后形成的小枯斑和大枯斑平均數(shù)變化趨勢(shì)并不一致。三生煙產(chǎn)生的小枯斑平均數(shù)在各接種病毒濃度下都比心葉煙的多；而對(duì)于大枯斑平均數(shù)，除了 6.356×10-2mg/mL處理組外，三生煙的在各接種病毒濃度下都比心葉煙的少（表2）。心葉煙接種病毒后產(chǎn)生的小枯斑平均數(shù)在各接種病毒濃度之間沒有太大變化，三生煙接種病毒后產(chǎn)生的小枯斑平均數(shù)有隨接種病毒質(zhì)量濃度增加而增加的趨勢(shì)。二因素方差分析結(jié)果表明，兩種煙草間大小枯斑數(shù)都有極顯著差異（p＜0.01），且各處理濃度的效應(yīng)也極顯著（p＜0.01）；三生煙接種病毒后產(chǎn)生的小枯斑數(shù)與處理濃度顯著相關(guān)（r=0.943，p=0.016＜0.05）。

3 小 結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種煙草接種病毒后形成的枯斑在形態(tài)上并無差異，心葉煙接種病毒后產(chǎn)生的全葉平均枯斑數(shù)與接種濃度顯著相關(guān)，因此可以認(rèn)為，心葉煙更適合用于抗TMV的枯斑寄主實(shí)驗(yàn)材料。

本試驗(yàn)中，在同一個(gè)濃度下，三生煙葉片上形成的小枯斑數(shù)顯著多于心葉煙，且三生煙葉片上形成的大枯斑數(shù)顯著少于心葉煙，這進(jìn)一步證明二者的過敏反應(yīng)存在差異。于翠等認(rèn)為N基因介導(dǎo)的過敏反應(yīng)所產(chǎn)生的枯斑大小是病毒在寄主體內(nèi)復(fù)制、運(yùn)動(dòng)與植物防御病毒侵染的綜合作用結(jié)果[6]。關(guān)于含N基因煙草接種TMV后形成枯斑大小的機(jī)制很復(fù)雜。一般認(rèn)為過敏反應(yīng)形成的枯斑較小，病毒被局限在較小的范圍內(nèi)，表明寄主植物對(duì)病毒侵染的響應(yīng)反應(yīng)迅速，間接說明寄主植物對(duì)病毒侵染有較好的抗性；反之，過敏反應(yīng)形成的枯斑較大，有的甚至是枯斑連片，導(dǎo)致寄主植物葉片較大面積枯死，以至嚴(yán)重影響到其正常生理，表明病毒在寄主植物細(xì)胞中擴(kuò)散速度較快，同時(shí)間接說明寄主植物對(duì)病毒的侵染抗性較差。因此，本實(shí)驗(yàn)表明，三生煙比心葉煙有更好的抗TMV擴(kuò)展效果。

[1]張曉燕，商振清，李興紅，等.TMV侵染對(duì)三生煙葉片中 Ca2+分布的影響[J].河北林果研究，2005，20（3）：239-241.

[2]翟梅枝，高芳鑾，沈建國(guó)，等.抗TMV的植物篩選及提取條件對(duì)抗病毒物質(zhì)活性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，32（7）：45-49.

[3]Otsnki Y,Shimonoa T,Tabkebe I.Tabacco mosaic virus multiplication and expression of the N gene in necrotic responding tobacco varieties[J].Virology,1972,50:45-50.

[4]Googing G V,Hebert T T.A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quantities[J].Phytopathology,1967,57(11):1285.

[5]陳學(xué)平，夏凱，孔繁明，等.煙草品種對(duì)TMV抗性差異的比較研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2001，22（1）：1-3.

[6]于翠，胡東維，董家紅，等.煙草花葉病毒和番茄花葉病毒在含N基因煙草上的癥狀差異是由運(yùn)動(dòng)蛋白基因決定的[J].中國(guó)科學(xué) C輯 生命科學(xué)，2004，34（3）：210-215.