劉曉霞，楊金廣，王鳳龍*，錢玉梅，申莉莉，張 帥，王長(zhǎng)栓，黃 瑾

(1.國(guó)家煙草專賣局煙草病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081；3.廣西壯族自治區(qū)煙草公司百色市分公司，廣西 百色 533000)

馬鈴薯Y病毒(PVY)是近年嚴(yán)重危害煙草生產(chǎn)的病毒之一，影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。當(dāng)前，檢測(cè) PVY的方法主要集中于生物學(xué)鑒定、光鏡和電鏡觀察、免疫學(xué)方法、RT-PCR檢測(cè)技術(shù)、核酸雜交檢測(cè)技術(shù)等[2-3]，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)對(duì)煙草PVY進(jìn)行定量檢測(cè)報(bào)道較少。筆者應(yīng)用 SYBR Green Real-time PCR技術(shù)，以煙草肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)參，建立了煙草中 PVY的定量檢測(cè)方法，旨在為快速、靈敏、高效檢測(cè) PVY含量提供有力的技術(shù)支持，同時(shí)也為煙草中其它病毒檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PVY毒源：純化的 PVY用接種緩沖液(0.01 mol/L PBS，PH7.0)研磨后，摩擦接種于枯斑三生煙(Nicotiana tabacumvar.samsun NN)，在防蟲(chóng)溫室中培養(yǎng)，每月擴(kuò)繁1次，以保持病毒侵染活性。

SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)、RNAiso Plus 、Reverse Transcriptase M-ML(RNase H-)、Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mixture、DL500 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。PVY DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自ADGEN公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PVY strain NTN isolate HR1全基因組序列(FJ204166)和actin基因(U60495)，按照標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，用Primer 5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后通過(guò)Oligo 6.0軟件對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過(guò)在線BLSAT程序( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進(jìn)行驗(yàn)證，以避免引物序列與煙草基因組任何序列同源。引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成。PVY 基因的上游引物為5’-TTCATCTCCATCCATCATAACC-3’，下游引物為5’-TACAACTTGCATACGACATAGG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 127 bp。Actin基因上游引物為5’-AAGGGATGCGAGGATGGA-3’，下游引物為5’-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為105 bp。

1.3 方法

1.3.1 煙草總RNA的提取 利用RNAiso Plus進(jìn)行煙草總RNA的提取，詳細(xì)方法參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄體系及條件 反轉(zhuǎn)錄體系和條件參照Reverse Transcriptase M-ML(RNase H-)的說(shuō)明書，反應(yīng)在東勝基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

1.3.3 Real-time PCR反應(yīng)體系及條件 參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)的說(shuō)明書，反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×) 12.5 μL，上下游引物(10 μM)各 0.5 μL ，cDNA 1 μL ，ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.5 μL，ddH2O 10 μL。

反應(yīng)采用兩步法PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)程序，并且制作融解曲線。反應(yīng)程序設(shè)置為3個(gè)階段。預(yù)變性階段：95℃ 10 s；PCR 反應(yīng)階段：95 ℃ 6 s，62 ℃ 35 s 重復(fù)35個(gè)循環(huán)；融解階段：95 ℃ 15 s，62 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s。在 PCR 反應(yīng)階段每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。

1.3.4 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和結(jié)果計(jì)算將PVY基因和actin基因的cDNA，采用5倍稀釋法稀釋成6個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。利用 AB7500 Real-Time PCR system 自帶的SDS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的線性公式，將樣品的 Ct值代入計(jì)算，經(jīng)過(guò)歸一化處理后得到PVY基因和actin基因的起始模板量，二者比值即為煙草中PVY基因的相對(duì)含量。

1.3.5 PVY Real-Time PCR定量檢測(cè)體系的應(yīng)用2008年和2009年采自廣西百色呈典型煙草病毒病的樣品30個(gè)，分別用PVY DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒(按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，Thermo Multiskan spectrum測(cè)定)和Real-time PCR定量檢測(cè)體系檢測(cè)PVY，比較二者檢測(cè)結(jié)果。

取PVY病樣0.1 g，液氮研磨后平均分為兩份，用提取緩沖液(DAS-ELASA試劑盒中提供)和RNAiso Plus 以10倍稀釋法各稀釋成10個(gè)梯度，分別進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)和Real-time PCR檢測(cè)，比較二者的檢測(cè)稀釋極限。

2 結(jié) 果

2.1 PVY基因和actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)稀釋的系列 cDNA起始模板量和循環(huán)閾值Ct的線性關(guān)系曲線見(jiàn)圖1。PVY基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和線性相關(guān)系數(shù)分別為-2.4447和 0.9960，actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和線性相關(guān)系數(shù)分別為-2.4106和 0.9961，兩者的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說(shuō)明擴(kuò)增效率高，可用于準(zhǔn)確定量。

2.2 Real-time PCR定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性分析

PVY基因和actin基因在 AB7500 Real-Time PCR system進(jìn)行擴(kuò)增，分析后得到的擴(kuò)增曲線和熔解曲線如圖2和圖3所示，兩個(gè)基因的擴(kuò)增曲線均呈典型的S型，基線平整，指數(shù)區(qū)斜率較大且比較平滑，空白對(duì)照一直保持水平，擴(kuò)增曲線比較理想；熔解曲線只有單一峰，說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。

圖1 PVY基因和actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1.Standard curve of PVY and actin gene

圖2 PVY基因和actin基因標(biāo)準(zhǔn)系列擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification plots of PVY gene and actin gene at different template amounts

圖3 PVY基因和actin基因熔解曲線Fig.3 Melting curve of PVY gene and actin gene

1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PVY基因和actin基因的Real-time PCR產(chǎn)物，溴化乙錠染色后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)(Pharmacia Biotech,Imagemaster VDS)采集圖像，結(jié)果如圖4所示。目的條帶單一，條帶大小與預(yù)期設(shè)計(jì)相符，進(jìn)一步說(shuō)明無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。

圖4 1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)PVY基因和 actin基因 Real-time PCR產(chǎn)物Fig.4 PVY gene and actin gene Real-time PCR products detected by 1.5% agarose gel

2.3 Real-time PCR定量檢測(cè)的重現(xiàn)性分析

以6個(gè)稀釋的系列cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR，3次重復(fù)的Ct值誤差和變異系數(shù)如表1所示，均較小，說(shuō)明該體系的重現(xiàn)性好。

表1 重現(xiàn)性分析(Ct值)Table 1 Repeatability test

2.4 Real-time PCR定量檢測(cè)體系的應(yīng)用分析

采自廣西百色呈典型煙草病毒病的30個(gè)樣品，用ELISA試劑盒檢測(cè)出8個(gè)煙草樣品被PVY侵染；用Real-time PCR定量檢測(cè)體系檢測(cè)出被PVY侵染的樣品有12個(gè)。DAS-ELISA試劑盒的檢測(cè)稀釋極限為105；而Real-time PCR定量檢測(cè)體系的檢測(cè)稀釋極限為109。以上結(jié)果說(shuō)明，PVY Real-time PCR定量檢測(cè)體系與DAS-ELISA相比，具有較高的靈敏性。并且，使用DAS-ELISA檢測(cè)耗時(shí)兩個(gè)工作日，而利用Real-time PCR檢測(cè)在1個(gè)工作日內(nèi)可以得到檢測(cè)結(jié)果，具有高效性。

3 討 論

目前，檢測(cè) PVY的方法主要集中于生物學(xué)鑒定、光鏡和電鏡觀察、免疫學(xué)方法、RT-PCR檢測(cè)技術(shù)、核酸雜交檢測(cè)技術(shù)等。對(duì) PVY的生物學(xué)鑒定主要依據(jù)寄主植物和傳播方式，耗時(shí)長(zhǎng)，受環(huán)境影響較大，檢測(cè)結(jié)果不可靠。光學(xué)顯微鏡觀察主要是基于 PVY在寄主細(xì)胞內(nèi)形成風(fēng)輪狀、柱狀、片層狀的內(nèi)涵體[1]。電鏡負(fù)染技術(shù)鑒定病毒優(yōu)點(diǎn)是直接、快速，尤其是免疫吸附電鏡，具有較高的靈敏性和特異性，但是不適合于樣品過(guò)多時(shí)使用。并且電鏡昂貴，操作電鏡需要一定的技術(shù)水平，不能達(dá)到普遍應(yīng)用的效果。RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，耗時(shí)較短，成本低，具有較高的靈敏性和特異性，因此一直受到普遍應(yīng)用。核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)(NASH)檢測(cè)病毒應(yīng)用也比較廣泛，Singh等[4]利用此技術(shù)檢測(cè)了馬鈴薯休眠塊莖中的PVY病毒，發(fā)現(xiàn)NASH比ELISA法更靈敏，更可靠，但是靈敏度和特異性比 RT-PCR差，而且在檢測(cè)大量樣品時(shí)，探針?lè)蛛x比較困難[5]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種新技術(shù)不斷推出，需要建立更為精確的檢測(cè)PVY的技術(shù)體系。

本研究通過(guò)與DAS-ELISA檢測(cè)技術(shù)的比較，發(fā)現(xiàn)Real-time PCR定量檢測(cè)技術(shù)具有更高的靈敏性，且檢測(cè)耗時(shí)短，效率高。但是real-time PCR定量檢測(cè)技術(shù)需要較昂貴的儀器設(shè)備，不適合于規(guī)模較小的實(shí)驗(yàn)室，這是該技術(shù)體系在應(yīng)用過(guò)程中的一個(gè)弊端。

孫淑斌等[6]研究指出，real-time PCR可以通過(guò)3種主要方法，達(dá)到理想的擴(kuò)增效果：縮短操作時(shí)間，盡量在冰上操作；專業(yè)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)適合的實(shí)時(shí)PCR引物；優(yōu)化反應(yīng)條件，改變退火、延伸溫度，反應(yīng)物濃度等。本研究設(shè)計(jì)按照標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，用Primer 5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后通過(guò)Oligo 6.0軟件對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過(guò)在線BLSAT程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)計(jì)的引物具有較高的特異性和最小的二級(jí)結(jié)構(gòu)。并且通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,最終確立了PVY real-time PCR定量檢測(cè)體系，為快速、靈敏、高效地定量檢測(cè)馬鈴薯Y病毒提供了有力的技術(shù)支持。

[1]朱賢朝，王彥亭，王智發(fā).中國(guó)煙草病害[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：209-216.

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