高志新 郝保同 劉寶林 王 欣 周國艷

1 引言

與平衡凍結(jié)過程相比，過冷度大的溶液往往形成尖細的樹枝狀晶體，細胞和細胞間隙組織更容易受到這種針尖狀晶體的機械損傷［1］。因此，通過提高低溫保護劑溶液的成核溫度，有效的降低溶液的過冷度，對細胞和組織的成功保存是非常重要的。

羥基磷灰石納米微粒由于具有極強的親水性表面和較小的體積，易在水溶液中懸浮，而且對細胞和生物組織沒有毒性，可誘發(fā)保護劑凍結(jié)過程的異相成核，提高過冷度。已有文獻證明了納米微粒在常溫狀態(tài)下可以增強流體的導熱系數(shù)［2］、傳熱效率［3］以及臨界熱流量［4］等。正是由于納米微粒在常溫狀態(tài)下表現(xiàn)的優(yōu)良特性，有些學者嘗試將納米微粒引入低溫生物學領域。Han［5］等將納米微粒加入到低溫保護劑中，發(fā)現(xiàn)納米微粒能提高溶液相變點以上的導熱系數(shù)和降低溶液的反玻璃化溫度，并從納米微粒顯著促進冰晶的成核過程做了初步解釋。但是納米微粒在相變點溫度以下，能顯著的增加溶液的粘度，影響低溫保護劑的分子結(jié)構(gòu)，進而影響了納米低溫保護劑的在降溫過程中的凍結(jié)特性，關于這方面的研究還鮮有報道。本實驗利用DSC研究了HA納米微粒對乙二醇溶液降溫過程的凍結(jié)參數(shù)，為進一步完善低溫保護劑的配置和細胞的成功保存提供了理論與方法支持。

2 材料與方法

2.1 材料

乙二醇(威爾昆化學試劑有限公司)為實驗用分析純試劑，純度＞99.8%。羥基磷灰石(HA)納米微粒純度為99.99%，形狀為半球形或者球形(南京埃普瑞納米材料有限公司)。溶液配制和儀器標定均采用二次蒸餾水。標定用的環(huán)戊烷(上海生化試劑公司)為色譜標準試劑，標定用水和溶液配制用水均為本實驗室生產(chǎn)的二次蒸餾水。乙二醇在使用前用CaH2處理并經(jīng)減壓蒸餾。二次蒸餾水使用前用0.2 um微孔濾紙過濾。

2.2 差示掃描量熱儀(DSC)

本實驗用差示掃描量熱儀為DSC-Pyris Diamond(美國Perkin-Elmer公司)。溫度標定采用環(huán)戊烷的晶-晶轉(zhuǎn)變點(外推起始溫度為-135.06℃)和二次蒸餾水的熔融溫度0℃(均采用外推起始溫度)進行兩點標定［6］。液氮冷卻采用CryofillTM，Perkin-Elmer公司的液氮容器控制。樣品沖洗氣體為高純度氦氣(純度 ＞ 99.999%)，流量30 mL/min保持不變。樣品皿為標準液體鋁皿(美國Perkin-Elmer公司)，樣品量為 5 mg—15 mg，精確到 ±0.01 mg。天平采用賽多利斯的BP211D，精確到0.01 mg。

2.3 試驗方法

溶液均以質(zhì)量濃度配置。乙二醇溶液的濃度分別為 0，1%，5%，15%20%，30%，40%。羥基磷灰石納米微粒的質(zhì)量濃度分別為0.05%，0.1%，和0.2%，粒徑分別為20 nm，40 nm，60 nm。納米微粒加入乙二醇溶液后采用細胞超聲震蕩粉碎儀震蕩，定時90分鐘，超聲功率為350 kW。樣品皿采用標準液體鋁皿，并用液固通用壓機(美國)壓制密封。每一個樣品都必須按照相同升降溫程序?qū)悠访蟆藴饰镔|(zhì)皿和空皿進行掃描，然后再進行下一個樣品。為消除試樣的熱歷史，加樣后首先將試樣以150℃/min快速升溫到所需溫度區(qū)間的上限，然后以150℃/min快速降溫到所需溫度區(qū)間的下限。如此重復2—3次，調(diào)至實驗起始溫度，恒溫3 min—5 min，然后以相同的降溫和升溫速率掃描并記錄熱流數(shù)據(jù)，掃描速率為10℃/min。待熱流穩(wěn)定后開始采集數(shù)據(jù)。每個樣品作3個平行樣，實驗結(jié)果取其平均值。

2.4 數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)變溫度采用熱分析軟件Pyris Software(美國Perkin-Elmer公司，5.0版本)讀取。在相變前后比熱變化不大時，用標準基線，變化較大時使用“S”形基線。成核溫度取臺階上升沿斜率最大點和基線交點對應的溫度即外推起始溫度。熔融溫度取熔融峰頂點溫度(peak)［7］。如圖1所示為40%乙二醇溶液降溫和復溫DSC熱流曲線。為方便起見，在取實驗結(jié)果時，將每個濃度對應的6組數(shù)據(jù)舍棄最大值和最小值，取4個數(shù)據(jù)的平均值作為分析的依據(jù)。

圖1 0.1%HA納米微粒+15%EG溶液降溫曲線Fig.1 DSC cooling thermograms of 0.1%HA nanoparticles and 15%EG solution

3 結(jié)果與討論

基于冰晶的成核理論［1］，在結(jié)晶過程中，母相中產(chǎn)生穩(wěn)定的新相核的過程稱為成核過程。根據(jù)成核機理的不同分為均相成核和異相成核。均相成核過程是由于液相內(nèi)的能量和密度的隨機起伏漲落，系統(tǒng)內(nèi)的分子不時的聚集成團而自發(fā)的成核過程。與均相成核相比異相成核更常見，異相成核是由于溶液中參雜了外來的雜質(zhì)顆?；蛘呓佑|已有的界面如容器壁面等，這些不純物質(zhì)和界面起到了晶種的作用。這樣的成核過程為異相成核。因此本實驗所說的成核溫度指的是異相成核溫度。

不同濃度的溶液其平衡凍結(jié)點是不同的，降溫時，溶液只有先過冷到其平衡凍結(jié)點以下的某個溫度，溶液中的水才開始凍結(jié)。溶液的平衡凍結(jié)點與成核溫度之差稱為溶液凍結(jié)的過冷度［8］。

3.1 HA納米微粒對不同濃度乙二醇溶液成核溫度的影響

由圖2可知加入HA納米微粒的乙二醇溶液與純乙二醇溶液相比較，在一定的濃度范圍內(nèi)，降溫或升溫過程所表現(xiàn)的相行為有許多相似之處。在降溫過程中，溶液均要先過冷到某一溫度才開始凍結(jié)，且凍結(jié)溫度隨著溶液濃度的增加而降低，原因是乙二醇分子與水分子之間有較強的氫鍵作用，這些氫鍵的存在降低了形成冰晶所需要的相變驅(qū)動力［9］。同結(jié)晶過程相比較，熔融過程在較寬的范圍內(nèi)完成的。在質(zhì)量濃度低于20%時，加入納米微粒后溶液成核溫度變化不明顯，但是當溶液濃度高于20%時，加入納米微粒能顯著的提高溶液的成核溫度?？赡艿脑蚴?，當溶液的濃度與納米微粒的加入量均較小時，此時溶液中水分子占據(jù)主導作用，因此溶液的成核特性更多的表現(xiàn)為純水的凍結(jié)特性。納米微粒，乙二醇分子及水分子之間的相互作用還不足以對溶液的凍結(jié)過程產(chǎn)生較大的影響。溶液凍結(jié)的隨機性比較大。但是隨著溶液濃度的增加，溶質(zhì)-溶劑之間的相互作用開始對溶解過程產(chǎn)生明顯的影響，主要表現(xiàn)在大大降低了溶液凍結(jié)的隨機性。

圖2 不同濃度的乙二醇溶液成核溫度Fig.2 Nucleation temperature of different concentrations of EG solution

3.2 不同粒徑和不同質(zhì)量濃度的HA納米微粒對EG溶液過冷度的影響

由表1可知對40%的乙二醇溶液加入不同粒徑和不同質(zhì)量濃度的HA納米微粒，溶液的成核溫度與過冷度均顯著的降低。加入HA納米微粒的粒徑越大或者質(zhì)量濃度越大，溶液過冷度降低的越顯著。

表1 用DSC測得加入HA納米微粒的乙二醇溶液的成核溫度和熔融溫度Table 1 Nucleation temperature and melting temperature of different concentrations of EG solution measured by DSC

將HA納米微粒加入乙二醇溶液中，HA納米微粒便起到了成核基體的作用，在異相成核過程中成核界面是已經(jīng)存在的，晶體的生長是由低能量的晶核和成核基體取代原先的界面，這種界面取代比界面產(chǎn)生所需能量小。即其成核勢壘小，所以異相成核將在比較小的過冷度下發(fā)生。在低濃度區(qū)間溶液的凍結(jié)隨機性較大，但是在中高濃度區(qū)間，由于溶液內(nèi)各組分之間的相互作用，有效的抑制了這種隨機性，溶液的凍結(jié)表現(xiàn)出較強的規(guī)律性。但是溶液的微觀結(jié)構(gòu)與溶液的宏觀性質(zhì)-過冷度到底存在一個什么樣的定量關系，單純的依靠DSC是很難做出解釋的。依靠異相成核的機理，定性的分析了HA納米微粒加入乙二醇溶液后的成核現(xiàn)象以及對溶液過冷度的影響。

圖3所示為異相成核示意圖。將HA納米微?？闯砂霃綖镽n的成核基體，晶胚為半徑是r的球冠，θ為其接觸角。異相成核時的臨界晶核半徑r*和臨界成核勢壘ΔG*

其中:

式中:σ12是納米粒子與流體之間的比表面自由能;σ23是晶核與納米粒子之間的比表面自由能;σ12是晶核與流體之間的比表面自由能。

圖3 異相成核示意圖

圖4給出了f(η，x)隨x的變化情況，由圖可見隨x增大，f(η，x)是減小的，這時ΔG*也減小，這表明當Rn增大時溶液容易成核，與實驗得出的結(jié)果相同。同時由于-1≤η≤1，對相同的x，η越大成核勢壘越小，較大的η也反映了濕潤程度大，這時雜質(zhì)基體與晶體之間的界面能σ23較小，故而利于成核。HA納米微粒具有較大的面積與體積比，和極強的親水性，即晶胚與納米微粒的濕潤程度較大，更加有利于冰晶的成核。

4 結(jié)論

利用差熱掃描熱儀(DSC)研究了HA納米微粒對乙二醇溶液的成核溫度和過冷度的影響。證明納米微粒能顯著的促進晶核的形成和降低溶液的過冷度。并通過異相成核簡要分析了納米微粒對保護劑溶液的作用機理。深入的分析納米低溫保護劑在降溫、復溫過程中產(chǎn)生的一系列熱力學變化以及納米微粒與溶液分子間的相互作用，為改進生物材料的低溫保存和研究納米微粒在低溫領域中的應用提供了理論基礎。

圖4 f(η，x)隨x的變化Fig.4 Relationship between f(η，x)with changes of x

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