王小巖，蔡懷涵，余 昊，李小蘭，宋 青

（北京科技大學(xué)應(yīng)用科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，北京 100083）

肝X受體（LXR）是近年來藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一，其生理調(diào)節(jié)作用涉及膽固醇、脂肪和糖代謝，與冠心病、2型糖尿病、老年癡呆的發(fā)生緊密相關(guān)，是治療這些常見病的藥物作用靶點(diǎn)[1-4]。最近研究報(bào)道，LXR-623作為首個(gè)進(jìn)入臨床人體試驗(yàn)的LXR激動(dòng)劑，在高劑量組中，實(shí)驗(yàn)者出現(xiàn)不同程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂癥狀，表現(xiàn)為頭昏、理解能力下降、健忘和偏執(zhí)意念等[5]。

為避免此類不良反應(yīng)出現(xiàn)，開發(fā)安全的LXR藥物，本實(shí)驗(yàn)初步建立了簡(jiǎn)單的動(dòng)物行為模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括魚、鴿子和小鼠三種常見的脊椎動(dòng)物，通過給藥LXR激動(dòng)劑豬脫氧膽酸二甲酰胺（王璐等，未發(fā)表數(shù)據(jù)），進(jìn)行小鼠曠場(chǎng)（openfield）實(shí)驗(yàn)[6]、鴿子自我識(shí)別（self-recognition）實(shí)驗(yàn)[7]、小魚躲避天敵實(shí)驗(yàn)，觀察LXR激動(dòng)劑對(duì)中樞神經(jīng)的影響，這將為篩選安全有效的LXR調(diào)節(jié)藥物提供研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1.1 第一批小鼠選用昆明白，雄性，8周齡，10只；第二批選用C57BL21，雄性，8周齡，10只；第三批選用昆明白，雄性，8周齡，40只；小鼠均購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.1.2 鴿子選用16只美國白羽王肉鴿，平均4年，雄雌各半，購于北京市大興區(qū)肉鴿飼養(yǎng)棚。

1.1.1.3 長(zhǎng)度為5 cm淡水魚、直徑為10 cm巴西龜，購于北京花鳥魚蟲市場(chǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

豬脫氧膽酸二甲酰胺（由本實(shí)驗(yàn)室合成），玻璃魚缸30 cm×20 cm×30 cm（長(zhǎng)×寬×高），攝像頭，照相機(jī)，分析天平。

1.2 方法

1.2.1 小鼠曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)

第一批昆明白小鼠、第二批C57BL21小鼠進(jìn)行曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)，給藥量均為200 mg/（kg·d）。為了觀察群體行為和平行比較，將每批的5只給藥組和5只對(duì)照組放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱子，對(duì)其在中心區(qū)域的穿越次數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。第三批選用昆明白小鼠40只，按平均體重分為5組，采取高密度籠養(yǎng)方法（8只/籠），進(jìn)行曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)來觀察環(huán)境壓力下的藥物作用。

1.2.2 鴿子自我識(shí)別實(shí)驗(yàn)

在鴿子飲用水中加入LXR激動(dòng)劑豬脫氧膽酸二甲酰胺，給藥量為 200 mg/（kg·d），喂養(yǎng) 16 h 后測(cè)試。 測(cè)試方式采用觀察鴿子對(duì)鏡面像和其他鴿子的相對(duì)關(guān)注程度，了解鴿子中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)，包括注意力、對(duì)其他個(gè)體的好奇程度、主動(dòng)交流的愿望、敏感性等。實(shí)驗(yàn)裝置為2個(gè)并排的網(wǎng)狀籠子，各放一只鴿子，一面放置鏡子，其他三面用白紙屏蔽，鴿子可以看見彼此及自己的鏡面像。每對(duì)鴿子在籠中放置5 min，然后用黑色記號(hào)筆在鴿子前部做一個(gè)明顯的記號(hào)，再在籠中放置5 min。整個(gè)過程攝制錄像保存數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)后分析。

1.2.3 魚躲避天敵實(shí)驗(yàn)

魚躲避天敵實(shí)驗(yàn)是通過向水中添加豬去氧膽酸二甲酰胺，使水中豬去氧膽酸二甲酰胺的濃度為20 μmol/L。按照體長(zhǎng)挑選出10只，平均分為兩組，每組5只，飼養(yǎng)在2個(gè)魚缸中。實(shí)驗(yàn)組水中含有豬去氧膽酸二甲酰胺，對(duì)照組為自來水。暴露時(shí)間為24 h，測(cè)試時(shí)將實(shí)驗(yàn)烏龜放入魚缸中并錄像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)

選用不同種系的小鼠（昆明白和C57BL21）做曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥組的動(dòng)物進(jìn)入中心區(qū)的次數(shù)多于對(duì)照組動(dòng)物（P<0.05）。 見表 1、2。

2.2 環(huán)境壓力下的藥物作用

為了觀察環(huán)境壓力下的藥物作用，本研究采取高密度籠養(yǎng)提高小鼠緊張度，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析藥物作用。結(jié)果顯示，在高密度籠養(yǎng)的環(huán)境壓力下籠養(yǎng)18 d后，LXR激動(dòng)劑改變動(dòng)物探索行為；但是與標(biāo)準(zhǔn)籠養(yǎng)密度條件下藥效相反，服藥動(dòng)物逐漸喪失進(jìn)入中心區(qū)的興趣，但是統(tǒng)計(jì)分析顯示無顯著差異（表 3）。

表1 昆明白小鼠曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Tab.1 Open-field test result of Kunmingbai mice()

表1 昆明白小鼠曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Tab.1 Open-field test result of Kunmingbai mice()

編號(hào) 空白對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組105229306459549平均次數(shù)2.207.60標(biāo)準(zhǔn)方差2.281.95平均進(jìn)食量（g）9.809.60平均飲水量（g）7.708.80平均體重（g）36.89±2.0432.63±3.15

表2 C57BL21小鼠曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Tab.2 Open-filed test result of C57BL21 mice()

表2 C57BL21小鼠曠場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Tab.2 Open-filed test result of C57BL21 mice()

編號(hào) 空白對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組128227327454597平均次數(shù)4.006.60標(biāo)準(zhǔn)方差3.081.52平均進(jìn)食量（g）9.0015.60平均飲水量（g）9.1010.90平均體重（g）24.33±0.9125.52±2.54

2.3 鴿子自我識(shí)別實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)觀察到較為明顯的行為差異，服用LXR激動(dòng)劑的鴿子表現(xiàn)出對(duì)鏡面像的好奇超出對(duì)照組。將鴿子照鏡子的行為分類為轉(zhuǎn)頭、低頭、挪步、轉(zhuǎn)身、梳羽和扇翅。每對(duì)鴿子對(duì)鏡面像的興趣大于對(duì)彼此的興趣，絕大多數(shù)時(shí)間與鏡面像對(duì)視。給藥組的鴿子表現(xiàn)出更強(qiáng)的主動(dòng)交流姿態(tài)和舉動(dòng)（表4）。但是在鴿子被標(biāo)記后（帶點(diǎn)），都表現(xiàn)出對(duì)鏡面像興趣和自主活動(dòng)下降的傾向（表5）。

表3 高密度籠養(yǎng)壓力下昆明白小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Tab.3 Open-field test result of Kunmingbai mice kept in high density()

表3 高密度籠養(yǎng)壓力下昆明白小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）Tab.3 Open-field test result of Kunmingbai mice kept in high density()

編號(hào)一次服藥量[mg/（kg·d）]050 100 200 300191109235100323000400300511200612111700100810100平均次數(shù)2.131.501.250.131.25標(biāo)準(zhǔn)偏差2.951.770.890.353.15平均進(jìn)食量（g）11.9818.8118.8915.1117.84平均飲水量（g）21.6024.6224.1225.7730.12平均體重（g）35.39±2.4433.00±1.0732.00±1.2032.25±1.0430.75±1.39

表4 鴿子自我識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析（不帶點(diǎn)）Tab.4 Pigeon mirror behavior test result(no spot)

2.4 魚躲避天敵實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給藥組的魚與對(duì)照組相比，啟動(dòng)躲避動(dòng)作的警戒區(qū)域明顯縮小，表現(xiàn)出對(duì)天敵的無畏行為（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未給出）。

表5 鴿子自我識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析（帶點(diǎn)）Tab.5 Pigeon mirror behavior test result(spot)

2.5 LXRα配體結(jié)合區(qū)的一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)

圖1 對(duì)比了人（h）、小鼠（m）、斑馬魚和雞（c）的部分序列，其中紅框內(nèi)的氨基酸殘基參與配體結(jié)合（<7埃）。

圖1 LXRα配體結(jié)合區(qū)的一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig.1 Alignment of LXRα LBD amino acid sequence

3 討論

LXR受體基因具有高度的種間保守性[8]。由圖1可以看出，這些物種的LXR受體配體結(jié)合區(qū)域的高度保守性，只有一個(gè)殘基不同（*號(hào)處），而其距配體距離有6埃以上不會(huì)直接影響配體結(jié)合的特異性?；谏鲜鼋Y(jié)構(gòu)分析可以推斷，能夠激活人LXR受體的激動(dòng)劑也可以激活其他物種的LXR受體。

大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)所含膽固醇比外周組織高出很多[9]。由于血-腦屏障的存在，含膽固醇的脂肪顆粒不能有效進(jìn)入大腦，所以大腦中95%的膽固醇是原位合成的。人體大腦隨年齡增加膽固醇含量逐步下降，而老年癡呆與大腦的膽固醇代謝存在一定的關(guān)聯(lián)性[10]。所以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽固醇代謝對(duì)其生理功能產(chǎn)生影響。LXR受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)表現(xiàn)在多種細(xì)胞種類內(nèi)，包括神經(jīng)細(xì)胞、星狀細(xì)胞和微星（腦巨噬）細(xì)胞[11]。LXR激動(dòng)劑可以上調(diào)ABCA1蛋白[12]、ApoE蛋白[13]，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，使細(xì)胞膜內(nèi)膽固醇濃度下降。神經(jīng)細(xì)胞的突觸結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞膜成分依賴性很強(qiáng)，膽固醇濃度下降可能會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞的生理活動(dòng)?？梢酝茰y(cè)，外源性高劑量LXR激動(dòng)劑急性使用，可能會(huì)非特異性地降低大腦神經(jīng)細(xì)胞的膽固醇含量，從而影響正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用LXR激動(dòng)劑豬脫氧膽酸二甲酰胺對(duì)魚、鴿子和小鼠的行為影響做了初步觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LXR激動(dòng)劑急性使用，改變了魚、鴿子和小鼠的正常行為，從而確定了LXR影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥效。臨床使用LXR調(diào)節(jié)劑，應(yīng)努力減小或避免對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良影響。本實(shí)驗(yàn)采用的思路可以為安全開發(fā)LXR調(diào)節(jié)劑提供簡(jiǎn)單可靠的動(dòng)物行為研究方法。

[1]Fiévet C,Staels B.Liver X receptor modulators:effects on lipid metabolism and potential use in the treatment of atherosclerosis[J].Biochem Pharmacol,2009,77(8):1316-1327.

[2]Wójcicka G,Jamroz-Wis'niewska A,Horoszewicz K,et al.Liver X receptors(LXRs).Part I:structure,function,regulation of activity,and role in lipid metabolism[J].Postepy Hig Med Dosw,2007,61(3):736-759.

[3]Jamroz-Wis'niewska A,Wójcicka G,Horoszewicz K,et al.Liver X receptors(LXRs).PartII:non-lipid effects,role in pathology,and therapeutic implications[J].Postepy Hig Med Dosw,2007,61(3):760-785.

[4]Geyereggera R,Zeydaa M,Stulniga TM.Liver X receptors in cardiovascular and metabolic disease[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(5):524-539.

[5]Arie K,Chandrasekhar U,Elyssa O,et al.Safety,pharmacokinetics,and pharmacodynamics of single doses of LXR-623,a novel liver X-receptor agonist,in healthy participants[J].The Journal of Clinical Pharmacology,2009,49(6):643-649.

[6]Wei XK,Si WC,Yu LL,et al.Effects of taurine on ret behavior in three anxiety models[J].Pharmacology,Biochemistry and Behavior,2006,83(9):271-276.

[7]Helmut P,Ariane S,Onur G.Mirror-induced behavior in the magpie:evidence of self-recognition[J].Plos Biology,2008,6(8):1642-1650.

[8]Reschly EJ,Ai N,Welsh WJ,et al.Ligand specificity and evolution of liver X receptors[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2008,110(1-2):83-94.

[9]譚來勛,孫圣剛.膽固醇與腦和突觸可塑性關(guān)系的研究進(jìn)展[J].卒中與神經(jīng)疾病,2006,13(6):383-385.

[10]Mauricio M,Carlos GD,Maria DL.Brain cholesterol in normal and pathological aging[J].BBA-Molecular and Cell Biology of Lipids,2010,3(21):311-351.

[11]Whitney KD,Watson MA,Collins JL,et al.Regulation of cholesterol homeostasis by the liver X receptors in the central nervous system[J].Molecular Endocrinology,2002,16(6):1378-1385.

[12]Costet P,Luo Y,Wang N,et al.Sterol-dependent transactivation of the ABC1 promoterby the liverXreceptor/retinoid X receptor[J].J Biol Chem,2000,275(36):28240-28245.

[13]Mak PA,Laffitte BA,Desrumaux C,et al.Regulated expression of the apolipoprotein E/C-I/C-IV/C-II gene cluster in murine and human macrophages[J].J Biol Chem,2002,277(35):31900-31908.