楊軍凱，劉 佳，張炳太

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普通外科，山西太原 030001；2.太原市中心醫(yī)院，山西太原 030009）

胰腺癌是惡性程度很高、預(yù)后很差的腫瘤，5年生存率＜5.0%，其發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、多基因變異累積的復(fù)雜過程，細(xì)胞的凋亡與增殖在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。促凋亡蛋白HtrA2/Omi可有效參與細(xì)胞凋亡過程，而Survivin是一種凋亡抑制蛋白，其特殊的分子結(jié)構(gòu)及在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的功能也早已引起人們的關(guān)注。本研究通過觀察胰腺癌中HtrA2/Omi、Survivin蛋白的表達(dá)情況，揭示兩者之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討其與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并為胰腺癌的診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

病例組40例，均為2005年10月～2009年10月我院手術(shù)切除并經(jīng)臨床診斷和病理檢查確診的胰腺癌患者，所有病例術(shù)前均未接受過放療或化療，其中，男24例，女16例；年齡42～78歲，平均52歲。按1997年UICC制訂的TNM分期，Ⅰ期8例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例。病理分化程度：高、中分化15例，低分化25例。選擇癌旁正常胰腺組織20例作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

兔抗人HtrA2/Omi多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人Survivin多克隆抗體購自福州邁新生物有限公司，SP試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

使用免疫組化SP法檢測(cè)胰腺癌及癌旁正常胰腺組織中HtrA2/Omi和Survivin的表達(dá)及分布情況，操作步驟依試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

HtrA2/Omi與Survivin均采用半定量積分法，將染色強(qiáng)度分為3級(jí)：無著色1分，淺著色2分，棕黃色3分；按陽性瘤細(xì)胞的百分比分3級(jí)：<25%為1級(jí)計(jì)1分，25%～75%為2級(jí)計(jì)2分，>75%為3級(jí)計(jì)3分。每張切片最后的得分為2次評(píng)分的乘積（1～9分），＜3分為陰性；≥3分為陽性，其中，3～4 分為（+），5～6 分為（++），7～9 分為（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析，免疫組織化學(xué)的陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，指標(biāo)間相關(guān)性用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HtrA2/Omi的表達(dá)

HtrA2/Omi在癌旁正常胰腺組織細(xì)胞的胞質(zhì)中存在表達(dá)（圖1），陽性表達(dá)率為30.0%，在胰腺癌中呈高表達(dá)（圖2），陽性表達(dá)率為82.5%，以胞質(zhì)呈棕黃色為陽性細(xì)胞，與腫瘤TNM分期、分化程度相關(guān)（表1）。胰腺癌組織中的HtrA2/Omi陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于癌旁正常胰腺組織（表2）。兩組HtrA2/Omi陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 HtrA2/Omi在正常胰腺中的表達(dá)（SP×200）Fig.1 The expression of HtrA2/Omi in normal pancreas （SP×200）

圖2 HtrA2/Omi在胰腺癌中的表達(dá)（SP×200）Fig.2 The expression of HtrA2/Omi in pancreatic carcinoma （SP×200）

2.2 Survivin的表達(dá)

Survivin在癌旁正常胰腺組織細(xì)胞中無陽性表達(dá)或低表達(dá)（圖3），陽性表達(dá)率為0，在胰腺癌組織胞核或胞質(zhì)中呈高表達(dá)（圖4），陽性表達(dá)率為72.5%。Survivin以胞核或胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表達(dá)細(xì)胞，與腫瘤TNM分期、分化程度、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)（表1）。胰腺癌組織中的Survivin陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于癌旁正常胰腺組織（表2）。兩組Survivin的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 胰腺癌組織中HtrA2/Omi、Survivin的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系（例）Tab.1 The relationship between the expression of HtrA2/Omi and Survivin in pancreatic carcinoma and the clinical pathology （case）

表2 HtrA2/Omi、Survivin在癌旁正常胰腺和胰腺癌組織中的表達(dá)（例）Tab.2 The expression of HtrA2/Omi and Survivin in normal pancreas and pancreatic carcinoma （case）

圖3 Survivin在正常胰腺中的表達(dá)（SP×200）Fig.3 The expression of Survivin in normal pancreas （SP×200）

2.3 HtrA2/Omi、Survivin之間的相關(guān)性分析

胰腺癌組中HtrA2/Omi的陽性表達(dá)與Survivin的陽性表達(dá)關(guān)系不大（r=0.105，P＞0.05）（表 3）。

圖4 Survivin在胰腺癌中的表達(dá)（SP×200）Fig.4 The expression of Survivin in pancreatic carcinoma （SP×200）

表3 HtrA2/Omi表達(dá)與Survivin表達(dá)的相關(guān)性（例）Tab.3 The correlation between the expression of HtrA2/Omi and Survivin （case）

3 討論

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物為維持自身穩(wěn)定、調(diào)控自身細(xì)胞增殖和死亡之間的平衡而由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，這一過程的紊亂與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，尤其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。HtrA2/Omi是一種重要的促凋亡蛋白，是一種寡聚絲氨酸蛋白酶，存在于大部分正常組織器官中，它由458個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為51 kD，編碼基因位于染色體2q13（或2p12），含有8個(gè)外顯子[1]。在最初的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，HtrA2/Omi可由線粒體膜間隙（mitochondrial intermembrane space）釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，接著出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡性死亡，這些現(xiàn)象表明HtrA2/Omi與細(xì)胞凋亡之間有著密切的關(guān)系[2-3]。

凋亡抑制蛋白家族（inhibitors of apoptosis family of protein，IAPs）是一類有抗凋亡活性的蛋白，至今已發(fā)現(xiàn)6個(gè)人類IAPs家族成員：XIAP、cIAP1/HIAP2、cIAP2/HIAP1、NIAP、Survivin、BRUCE[4]。IAP 主要有 3個(gè)結(jié)構(gòu)域，BIR、RING、CARD 結(jié)構(gòu)域，其中BIR結(jié)構(gòu)域全稱為桿狀病毒IAP重復(fù)序列，為IAP抑制細(xì)胞凋亡所必需的，所有IAP家族成員至少含有一個(gè)BIR，大多數(shù)含有3個(gè)BIR[5]。Aurvivin是IAP家族中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新成員，于1997年由耶魯大學(xué)的Smbrosini等[6]用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1（effector cell protease receptor-1，EPR-1）cDNA在人類基因組庫的雜交篩選中首先分離出來。Survivin與其他IAP成員不同，Survivin單體NH3端只含有一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)。Survivin表達(dá)于胚胎、胎兒組織[7]以及大多數(shù)常見的腫瘤組織，如肺、胃、結(jié)腸、胰腺、乳腺、肝臟、前列腺以及大約50%的非霍奇金淋巴瘤，但不表達(dá)于終末分化的成人組織中[6]。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，Caspase-3作為Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[8]，Survivin通過一種BIR依賴性的方式與Caspase-3和Caspase-7相結(jié)合，并抑制其活性，從而抑制凋亡。Satoh等[9]發(fā)現(xiàn)，Survivin在胰腺腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)，在正常胰腺或慢性胰腺炎細(xì)胞中不表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。

當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，完整的HtrA2/Omi能進(jìn)行自我加工，去除N末端133個(gè)氨基酸殘基的跨膜部分，形成成熟的HtrA2/Omi[10]，并從線粒體膜間隙穿過線粒體膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中與IAPs結(jié)合，從而解除IAPs對(duì)Caspases的抑制。同時(shí)，HtrA2/Omi對(duì)IAPs的抑制作用不僅僅來自于對(duì)IAPs的直接結(jié)合降解作用，它還可以抑制IAPs蛋白的翻譯[11]。HtrA2/Omi除了通過促進(jìn)Caspase活化參與細(xì)胞凋亡過程外，還可以直接利用其蛋白酶活性發(fā)揮促凋亡作用[1]。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HtrA2/Omi、Survivin在胰腺癌中的表達(dá)均明顯增高。HtrA2/Omi的表達(dá)與胰腺癌的分化、分期相關(guān)，在分化差和臨床晚期胰腺癌組織中HtrA2/Omi表達(dá)減少，而在腫瘤分化高和臨床早期肝癌組織中結(jié)果相反，提示HtrA2/Omi與胰腺癌的發(fā)展密切相關(guān)，可能促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的凋亡，其減少或缺失是胰腺細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的一個(gè)重要因素。Survivin的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤部位并無相關(guān)性，但在有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、高分化與低分化癌、Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期間有顯著差異，表明Survivin在胰腺腫瘤從良性到惡性的轉(zhuǎn)化中起重要作用，并進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤發(fā)展。以Survivin為靶點(diǎn)治療胰腺癌目前尚處于實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)基因治療的療效和風(fēng)險(xiǎn)也仍然存在較大爭議，但Survivin特異表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織這一特點(diǎn)為治療胰腺癌提供了新思路，臨床應(yīng)用前景樂觀；但在本研究中發(fā)現(xiàn)HtrA2/Omi與Survivin關(guān)系不大，說明兩者在細(xì)胞凋亡通路中，通過不同途徑發(fā)揮各自的生物學(xué)作用，HtrA2/Omi不作用于Survivin，這與Verhagen等[12]的報(bào)道一致，可能與Survivin獨(dú)特的結(jié)構(gòu)有關(guān)，同HtrA2/Omi無法結(jié)合降解。這就需要我們進(jìn)一步探索能有效抑制Survivin的特異性促凋亡蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，為惡性腫瘤的治療提供新途徑，為腫瘤基因治療提供新的可能的靶位。同時(shí)，進(jìn)一步深入研究HtrA2/Omi、Survivin在胰腺癌細(xì)胞生長中的作用對(duì)胰腺癌的治療有重要意義。

[1]王曉,王瑾,呂小萍,等.線粒體絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2與細(xì)胞凋亡[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2006,37(3):286.

[2]Garrido C,Kroerner G.Life's smile,death's grin:vital functions of apoptosis-executing proteins[J].Curr Opin Cell Biol,2004,16(6):639-646.

[3]周彩虹,黃啟福.凋亡與腫瘤及其治療進(jìn)展[J].中國病理生理雜志,2004,20(11):172-181.

[4]紀(jì)慶,楊純正.IAP蛋白小分子抑制劑研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究通訊,2004,33(6):30-32.

[5]Crook NE,Clem RJ,Miller LK,et al.An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif[J].J Virol,1993,67(4):2168-2174.

[6]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nature Med,1997,(8):917-921.

[7]Adida C,Crotty PL,Mc Grath J,et al.Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene survivin in human and mouse differentiation[J].Am J Pathol,1998,152(1):43-49.

[8]Cryns V,Yuan J.Protease to die for[J].Genes Dev,1998,12(11):1551-1570.

[9]Satoh K,Kaneko K,Hirota M,et al.Expression of Survivin is correlated with cancer cell apoptosis and is involved in the development of human pancreatic duct cell tumors[J].Cancer,2001,92(2):271-278.

[10]Li W,Srinivasula SM,Chai J,et al.Structural insights into the proapoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi[J].Nat Struct Biol,2002,9(6):410-412.

[11]Holley CL,Olson MR,Colon-Ramos DA,et al.Reaper eliminates IAP proteins through stimulated IAP degradation and generalized translational inhibition[J].Nat Cell Biol,2002,4(6):439-444.

[12]Verhagen AM,Ekert PG,Pakusch M,et al.Identification of DIABLO,a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins[J].Eur J Biochem,2000,267:5699-5710.