杜 丹，胡成進，孔立新，王延群，孫子涵，孫 黎，林 靜

隨著自動血細胞分析技術的飛速發(fā)展，及全自動血細胞分析儀的廣泛使用，傳統(tǒng)的血涂片顯微鏡檢查法，逐漸成為儀器檢測結(jié)果的補充方法。但眾所周知，血細胞分析儀白細胞分類計數(shù)功能僅體現(xiàn)在血細胞形態(tài)和比率大致正常的情況下，當存在形態(tài)異常的細胞時，儀器便很難準確識別分辨，此時必須進行涂片復檢[1]。如何更好的將儀器法提供的參數(shù)與人工鏡檢相結(jié)合，為臨床提供更加準確完善的檢測報告，是目前各國血液學專家都在共同關注的課題[2-6]。國際血液學復檢專家組歷時3年通過對13 298份血液學標本進行分析后，于2005年提出了41條自動血細胞分析和分類復檢規(guī)則（后簡稱“國際復檢規(guī)則41條”）[6]，2008年叢玉隆教授帶領的“XE－2100復檢協(xié)作組”聯(lián)合國內(nèi)三家大型醫(yī)院用1年的時間通過對3 594份臨床血液標本的分析，制定了適合中國人群應用XE－2100血細胞分析儀的白細胞分類涂片復檢規(guī)則23條（后簡稱“XE－2100復檢規(guī)則23條”）[7]。但由于各實驗室所使用血細胞分析儀的性能特點不同，醫(yī)院規(guī)模及病種差異不同，即使是同一型號的儀器因?qū)嶒炇乙蟛煌Y選標準也可不同，因此各實驗室應根據(jù)自身特點制定適應實驗室應用的血細胞復檢規(guī)則。為此，筆者結(jié)合所在實驗室儀器特點及醫(yī)院要求，在 “XE－2100復檢規(guī)則23條”的基礎上，結(jié)合“國際復檢規(guī)則41條”，制定了適合所在實驗室常規(guī)工作需求的自動血細胞計數(shù)與WBC分類的復檢規(guī)則。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 1 212份血常規(guī)標本，EDTA-K2抗凝，均來自濟南軍區(qū)總醫(yī)院住院患者，其中初診標本934份，復診標本278份，所有標本均在采血后4 h內(nèi)檢測完畢并推片染色。

1.1.2 儀器與試劑 主要儀器為Sysmex HST－302全自動血細胞分析流水線，包括Sysmex XE－2100全自動血細胞分析儀2臺，SP－1000i自動推片機1臺，原裝配套試劑、質(zhì)控品均由日本Sysmex公司提供。Olympus雙筒顯微鏡購自日本奧林巴斯光學株式會社。

1.2 方法

1.2.1 儀器的調(diào)試與校準 評估前，由Sysmex公司的工程師用Sysmex校準物對2臺儀器進行校準，并將儀器的靈敏度調(diào)整到同一水平，然后用高中低三個水平的質(zhì)控品對2臺儀器進行比對，保證儀器間結(jié)果一致性。試驗期間每日均用全血質(zhì)控品進行嚴格的室內(nèi)質(zhì)量控制，以監(jiān)測結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。

1.2.2 檢測方法 所有標本按臨床標本的常規(guī)檢測流程和方法進行全血細胞分析檢測并推片瑞氏染色，由推片機自動編號打印日期，由長期從事細胞工作并具有中級以上職稱的檢驗人員按照文獻[2]方法進行鏡檢。每張血涂片由2人分別鏡檢，取平均值。內(nèi)容包括：①WBC分類計數(shù)：每人計數(shù)100個WBC，取均值為人工WBC分類值，并進行形態(tài)學觀察；②WBC和PLT數(shù)量評估；③RBC和PLT的大小、染色及形態(tài)學觀察；④有無巨大血小板及血小板聚集；⑤NRBC、RBC冷凝集及寄生蟲等。

1.2.3 初步復檢規(guī)則的制定 按照國內(nèi) “XE－2100復檢協(xié)作組”制定的“XE－2100復檢規(guī)則23條”執(zhí)行[7]。

1.2.4 血涂片陽性判斷標準 按照全國血液學復檢專家小組提出的12條血細胞自動計數(shù)復檢標準執(zhí)行[9]。①紅細胞明顯大小不等（指細胞大小相差1倍以上）；中空淡染 （指>1/2淡染區(qū)的紅細胞＞30%）；②巨大血小板＞15%；③見到血小板聚集；④Dohle小體的粒細胞＞10%；⑤中毒顆粒中性粒細胞＞10%；⑥空泡變性粒細胞＞10%；⑦原始和幼稚細胞≥1%；⑧早幼粒細胞和中幼粒細胞≥1%；⑨晚幼粒細胞＞2%；⑩異型淋巴細胞＞5%；⑾NRBC≥1%；⑿漿細胞≥1%。

1.2.5 初檢規(guī)則的評估方法 將“XE－2100復檢規(guī)則23條”輸入XE－2100血細胞分析儀的Laboman4.2程序，儀器結(jié)果觸發(fā)任一條規(guī)則即為儀器陽性，以人工鏡檢的結(jié)果對初檢規(guī)則進行評估，以鏡檢結(jié)果為金標準，評估初檢規(guī)則對標本判斷的真陽性、假陽性、真陰性、假陰性，并進行統(tǒng)計學分析。真陽性定義為觸發(fā)規(guī)則且鏡檢結(jié)果為陽性；假陽性定義為觸發(fā)規(guī)則但鏡檢結(jié)果為陰性；真陰性定義為不觸發(fā)規(guī)則且鏡檢結(jié)果為陰性；假陰性定義為不觸發(fā)規(guī)則但鏡檢結(jié)果為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析 試驗數(shù)據(jù)采用XE－2100復檢協(xié)作組與Sysmex公司聯(lián)合開發(fā)專用的Laboman4.2軟件及Microsoft Excel軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1 初檢規(guī)則的應用評估 通過對1 212份標本的儀器檢測結(jié)果和人工鏡檢結(jié)果對比，對“XE－2100復檢規(guī)則23條”進行評估，統(tǒng)計結(jié)果顯示真陽性率47.5%（576/1 212），假陽性率 14.6%（177/1 212），真陰性率29.0%（351/1 212），假陰性率 8.9%（108/1 212），通過對23條規(guī)則詳細對比分析顯示，假陽性出現(xiàn)較多的規(guī)則是嗜堿性粒細胞絕對值、未成熟粒細胞、核左移、原始細胞和有核紅細胞；假陰性出現(xiàn)最多的規(guī)則是未成熟粒細胞及核左移，其次是異型淋巴細胞、原始細胞和少量的有核紅細胞，閱片過程中發(fā)現(xiàn)PLT聚集、巨大血小板2項出現(xiàn)假陰性頻率較高。

2.2 筆者所在實驗室XE－2100血細胞復檢規(guī)則的制定 根據(jù)對“XE－2100復檢規(guī)則23條”的評估結(jié)果，及初檢規(guī)則觸發(fā)情況的詳細分析，結(jié)合“國際復檢規(guī)則41條”，初步擬定了適合筆者所在實驗室常規(guī)工作要求及儀器特點的血細胞分析復檢規(guī)則（表1）。

2.3 驗證試驗 為了驗證制定的復檢規(guī)則的有效性，將其設置在XE－2100的Laboman4.2軟件中，選擇200份標本進行驗證，并與人工鏡檢結(jié)果進行對比分析，結(jié)果顯示該規(guī)則的復檢率為26.5%（53/200）， 真陽性率為 44.5%（89/200）， 假陽性率為19.0%（38/200），真陰性率為 33.0%（66/200），假陰性率為3.5%（7/200）。假陽性主要由嗜堿性粒細胞絕對值、未成熟粒細胞、核左移和有核紅細胞引起，假陰性主要由巨大血小板、血小板聚集、異形淋巴細胞和少量有核紅細胞引起。

3 討 論

“XE－2100復檢規(guī)則23條”在筆者所在實驗室Sysmex HST－302全自動血細胞分析流水線上應用后發(fā)現(xiàn)，1 212份標本中，假陽性出現(xiàn)較多的規(guī)則是嗜堿性粒細胞絕對值、未成熟粒細胞、核左移，還有少量原始細胞和有核紅細胞，假陰性出現(xiàn)最多的規(guī)則是未成熟粒細胞及核左移，其次是異型淋巴細胞、PLT聚集、巨大血小板、原始細胞和少量的有核紅細胞。由此可見出現(xiàn)假陽性和假陰性較多的規(guī)則集中在未成熟粒細胞、核左移，原始細胞和有核紅細胞幾項，經(jīng)反復測試多方查找原因后發(fā)現(xiàn)：①筆者所在實驗室所用2臺XE－2100血細胞分析儀并未開通有核紅通道，故對有核紅細胞的陽性報警僅能作為參考信息，工作人員應在此基礎上進行人工鏡檢，計數(shù)有核紅細胞百分數(shù)，并計算校正后白細胞總數(shù)；② XE－2100五分類血細胞分析儀對未成熟粒細胞的檢測方法為射頻加阻抗法，對幼稚細胞的識別應該較為準確，復查核對中發(fā)現(xiàn)部分未成熟粒細胞出現(xiàn)假陰性且白細胞未分類的標本，在IPU里已有未成熟粒細胞報警信息提示，而且超出了陽性臨界值，但Labomanr4.2卻沒有提示未成熟粒細胞陽性，其原因可能與未分類標本的相關設置有關，或者為IPU和Laboman4.2之間的傳輸問題，上述標本因未分類觸發(fā)了DC規(guī)則，所以并未造成漏檢，但該問題已與廠家工程師聯(lián)系期待有效解決，避免在以后的工作中造成漏檢；③嗜堿性粒細胞絕對值假性偏高是近期出現(xiàn)的問題，尤其是肺癌等腫瘤化療患者其散點圖出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象，筆者抽取部分假陽性標本用其他實驗室的同型號儀器進行檢測，結(jié)果全部陰性，即無一例提示嗜堿性粒細胞絕對值偏高。該結(jié)果提示，筆者所在實驗室使用的XE－2100血細胞分析儀在嗜堿性粒細胞計數(shù)方面敏感度偏高，應對儀器進行重新校正后使用。另一方面，筆者所在醫(yī)院近期更換了部分2 ml肝素抗凝管，有可能這種型號的抗凝管儲存的標本會對儀器的檢測造成一定影響。另外，巨大PLT假陰性率較高，可能是由于儀器在分類時將部分巨大PLT誤認為小淋巴細胞所致，故在復檢規(guī)則里添加了MPV報警一項，以期進一步降低假陰性率。

表1 筆者所在實驗室HST－302血細胞分析流水線復檢規(guī)則25條

在本次評估中發(fā)現(xiàn)Sysmex XE－2100全自動血細胞分析儀在細胞計數(shù)方面的準確度比較高，其白細胞分類的絕對值和百分率與人工鏡檢分類的結(jié)果有較好的符合度，“XE－2100復檢規(guī)則23條”中3－14條計數(shù)規(guī)則基本符合筆者所在實驗室的工作需求，出現(xiàn)的假陽性和假陰性率都較低，因此在后續(xù)規(guī)則的制定中未做較多調(diào)整。但對部分異常細胞的判斷儀器報警與人工鏡檢結(jié)果有一定偏差，如紅細胞大小不等、中空淡染、異形淋巴細胞和巨大血小板等，這可能與儀器的靈敏度有關，也與閱片者的技術水平及涂片中細胞分布的差異有關。但在目前的研究中尚未有因紅細胞形態(tài)異常造成假陽性或假陰性的情況出現(xiàn)。

在制定復檢規(guī)則的過程中，根據(jù)評估結(jié)果并結(jié)合臨床醫(yī)師的建議，對“XE－2100復檢規(guī)則23條”進行了部分調(diào)整。所遵循的原則是：①建立一份適合筆者所在實驗室實際工作需求的復檢規(guī)則；②在保證篩選質(zhì)量的基礎上盡量降低復檢率；③假陰性率控制在5%以下，具有診斷意義的重要參數(shù)不能出現(xiàn)假陰性；④在較低假陰性的基礎上降低假陽性率[1]。筆者針對導致假陰性和假陽性較高的規(guī)則做了相應調(diào)整，增加了PLT聚集和巨大PLT兩項。驗證結(jié)果表明，假陽性率（19.0%）有所提高但未超過血液學復檢專家組認可的許可范圍，假陰性率降至為3.7%，符合血液學復檢專家組認可的<5%的許可范圍，并且血液病標本無漏檢。

臨床實驗室制定的涂片復審標準使用后，隨著儀器使用時間延長應定期對復檢規(guī)則進行評估校正，不斷改進和完善以保證其與儀器的匹配度長期有效。

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