黃 帆,王明玖,何麗君,陳麗麗

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019）

①豆科牧草是草地的重要組成部分,是家畜主要蛋白質(zhì)飼料的來源[1]。豆科牧草多數(shù)具備產(chǎn)量高、品質(zhì)好、易于栽培的特點,是飼料牧草領(lǐng)域研究較多且較廣的科、屬之一[2]。三葉草屬Tri folium植物,屬一年生或多年生草本,是一種優(yōu)良的豆科牧草。高加索三葉草是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院從國外引進的一個優(yōu)良草種。經(jīng)過多年的連續(xù)試驗觀察,對其生物學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)等特性及生產(chǎn)性能和適應(yīng)性有了系統(tǒng)認識,其草產(chǎn)量高,抗旱、抗寒能力很強[3-4],但其固氮能力很差。國內(nèi)學(xué)者對白三葉T.repens研究較多,其產(chǎn)量高,根瘤固氮能力強,根系淺,喜濕、喜暖[5-11]。研究表明,高加索三葉草T.ambiguum與白三葉是具有親緣關(guān)系的2個種[12],為了結(jié)合2種三葉草的優(yōu)點,克服各自的不足,已利用遠緣雜交和胚培養(yǎng)技術(shù)得到雜交F1代[13]。試驗以雜交F1代的莖段作為外植體,通過組織培養(yǎng)的直接器官發(fā)生方式建立擴繁體系,為進一步回交恢復(fù)后代育性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況高加索三葉草從新西蘭引進,供試材料為在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田內(nèi)栽培生長第7年的植株。白三葉為從大興安嶺采集、在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田種植后的越冬植株。試驗田位于 40°49′N 、114°41′E,海拔1 063 m。該地為典型大陸性氣候,光照充足,年均降水量約400 mm；多年平均氣溫5.4℃,1月極端最低溫-32.8℃。初霜期多在9月下旬,晚霜期一般在5月中旬。田內(nèi)土壤為砂質(zhì)栗鈣土,pH值約7.5,土壤具有中等肥力,有灌溉條件。

試驗以高加索三葉草為母本,白三葉草為父本進行雜交后未成熟胚離體培養(yǎng)獲得的F1代無菌苗的莖段作為外植體,進行不定芽的誘導(dǎo)、分化及生根試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1不定芽的誘導(dǎo) 將F1代無菌苗的莖分別切成1 cm左右的小段接種在添加不同質(zhì)量濃度2,4-D、6-BA、NAA的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,其中蔗糖2%,瓊脂0.75%,培養(yǎng)基的pH 值為6.0。每瓶培養(yǎng)基中接種5個莖段,每種培養(yǎng)基各接種20瓶。接種完畢后將其放在實驗室內(nèi)培養(yǎng),每日光照10～12 h,光照強度為 18 000～22 000 μ mol/（m2·s）,室內(nèi)溫度保持在27℃左右。

1.2.2不定芽的分化培養(yǎng) 培養(yǎng)4周后將誘導(dǎo)直接產(chǎn)生的不定芽分別接種到添加不同質(zhì)量濃度2,4-D、6-BA、NAA 、KT 的MS分化培養(yǎng)基上,其中蔗糖2%,瓊脂0.7%,培養(yǎng)基的pH值為6.0,每種培養(yǎng)基接種20瓶,并根據(jù)不同的激素配比將培養(yǎng)基分為Q系列、R系列和T系列。之后每隔30～35 d繼代一次,并統(tǒng)計分化率。

分化率=不定芽分化的塊數(shù)/接種的總塊數(shù)

1.2.3根的誘導(dǎo) 分化產(chǎn)生的不定芽長到3.0～4.0 cm時,將其分別接入添加不同質(zhì)量濃度NAA、IBA的MS培養(yǎng)基以及不添加任何激素的1/2MS、MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根,其中蔗糖1.5%,瓊脂0.75%,培養(yǎng)基的pH值為6.0。定期觀察生根情況,篩選最適合的生根培養(yǎng)基。

1.2.4完整植株的形成與移栽 將生根后形成的小植株在培養(yǎng)室內(nèi)進行煉苗,3～5 d后待培養(yǎng)基表面開始染菌時,沖洗根部的培養(yǎng)基,栽種于高溫滅菌后的珍珠巖∶沙土=1∶1（體積比）的基質(zhì)中,每日觀察其生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的誘導(dǎo)將雜種F1代無菌苗的莖段接種在編號為D1～D11的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（圖1）。接種1周左右莖段的兩端開始膨大。20 d后部分外植體愈傷化,產(chǎn)生的愈傷組織為淡綠色,結(jié)構(gòu)緊密；部分外植體直接分化產(chǎn)生不定芽。不同激素組合的MS培養(yǎng)基對雜交F1代莖段不定芽的誘導(dǎo)有不同的影響,11種培養(yǎng)基中只在D4和D8培養(yǎng)基中有器官發(fā)生現(xiàn)象（圖2）,這2種培養(yǎng)基中6-BA的質(zhì)量濃度相同。另外,隨著2,4-D質(zhì)量濃度的增加,產(chǎn)生的不定芽也增加,但D8培養(yǎng)基中同時伴隨較高的褐化率?？梢?,4-D質(zhì)量濃度是誘導(dǎo) F1代莖段不定芽的關(guān)鍵因素。最終選擇添加2,4-D 0.1 mg/L、6-BA 2 mg/L的D4培養(yǎng)基為不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基,進行試驗。

圖1 雜交F1代無菌苗莖段不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基

2.2 不定芽的分化培養(yǎng)約30 d后,將誘導(dǎo)形成的不定芽分別接種在編號為Q1～Q10,R1～R14,T1～T7的培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)并統(tǒng)計分化率（表1）。大約經(jīng)歷40 d部分不定芽逐漸伸長形成莖和葉（圖3）,部分則褐化死亡。由表1可以看出不同激素類型及不同質(zhì)量濃度配比的培養(yǎng)基對不定芽的分化影響。分化率最高的為T系列培養(yǎng)基,整體分化率都在80%以上,相比之下,R系列培養(yǎng)基整體分化率較低,只有 R8、R9、R13、R14分化率在70%以上,而Q系列培養(yǎng)基分化率居中。Q系列培養(yǎng)基中,在6-BA含量不變的情況下,通過對生長素2,4-D進行梯度添加,來篩選適宜的分化培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)添加2,4-D 0.04 mg/L、6-BA 2 mg/L的Q4培養(yǎng)基的分化率最高。R系列培養(yǎng)基中,將 R1～R7與R8～R14對比可以發(fā)現(xiàn),降低培養(yǎng)基中6-BA的含量利于不定芽的分化 ,添加 0.5、0.75、1.0 mg/L NAA 的培養(yǎng)基分化率較低,而添加低于0.5 mg/L NAA和高于1.0 mg/L NAA的培養(yǎng)基分化率相對較高。T系列培養(yǎng)基（圖4）在R系列培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了1.0 mg/L的 KT,整體的分化率均為80%以上,KT對F1代莖段不定芽的分化過程影響較大（表1）。

圖2 誘導(dǎo)形成不定芽

圖3 不定芽逐漸伸長

圖4 分化形成的小植株

表1 不同質(zhì)量濃度激素配比培養(yǎng)基對不定芽分化的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對生根的影響將分化形成的植株叢分別接入10種不同激素配比的生根培養(yǎng)基中（表2）,定期觀察生根情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)植株叢在G1、G2培養(yǎng)基中不生根；在G3、G7以及G8培養(yǎng)基中生根速度慢且根系不夠發(fā)達；在G4、G5以及G6培養(yǎng)基中生成的根粗,但生根速度慢；在1/2MS培養(yǎng)基中生根效果最佳,根系較發(fā)達（圖5）。由表2可以看出,添加了激素的培養(yǎng)基中,生根速度較不添加任何激素的慢；植株叢在同時添加了NAA和IBA兩種激素的培養(yǎng)基中生根較粗,但是生根速度較慢；在單獨添加NAA或IBA的培養(yǎng)基中生根速度慢且根系不發(fā)達；1/2 MS培養(yǎng)基較MS培養(yǎng)基生根效果更佳,最終選用1/2MS培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基。

圖5 1/2MS培養(yǎng)基生根效果

表2 不同濃度激素配比培養(yǎng)基對不定芽生根的影響

2.4 植株的馴化與移栽組織培養(yǎng)苗是在溫度恒定和高度濕潤的條件下生長的,主要的代謝方式為異養(yǎng)。由于組織培養(yǎng)苗的特殊生活環(huán)境,使它的外部特征和生理特性與大田里的植株有明顯差別[14]。在煉苗的過程中應(yīng)盡量保持濕度和避免強光輻射,避免組織培養(yǎng)苗葉片氣孔過多的蒸騰。在試驗中,為了使F1組織培養(yǎng)苗能較快適應(yīng)移栽后的溫度、光照和有菌環(huán)境,移栽后于苗的周圍蓋上一層薄膜來控制濕度,同時放在弱光的地方。在溫室內(nèi)培養(yǎng)1周左右,去掉薄膜,然后將其放到陽光充足的地方繼續(xù)培養(yǎng)。有新葉長出代表小苗移栽成功,試驗按以上方法移栽,其成活率可達80%以上。

3 討論

在植物組織培養(yǎng)中,植株再生可通過不定芽或體細胞胚胎發(fā)生等途徑實現(xiàn)[15-16]。不定芽可以從外植體脫分化形成的愈傷組織中發(fā)生,屬間接器官發(fā)生途徑；也可以不經(jīng)過愈傷組織直接從外植體上分化形成,屬直接器官發(fā)生途徑[17]。通過適合的培養(yǎng)條件和激素配比的誘導(dǎo),同一植物中體細胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生有可能會同時出現(xiàn)。據(jù)不完全統(tǒng)計,在至今報道的上千種形成再生植株的植物中,兼具這2條途徑的植物僅有幾十種,例如槐樹Sophora japonica植株再生兼具這2種途徑[18],胡鳳榮等[19]研究東方百合Lilium oriental的愈傷組織在MS培養(yǎng)基中添加2,4-D時進行暗培養(yǎng),也可同時誘導(dǎo)出不定芽和體細胞胚胎。

培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度直接影響體細胞愈傷組織及器官發(fā)生與否及其生長情況。本試驗采用直接器官發(fā)生方式,以F1代莖段作為外植體,直接誘導(dǎo)出了大量不定芽。器官直接發(fā)生方式與間接發(fā)生方式相比,其優(yōu)勢在于縮短了從外植體到獲得完整植株的周期,降低了組培成本,同時這一途徑的變異頻率相對較低,確保了克隆的再生植物的遺傳穩(wěn)定性[20]。

組織培養(yǎng)苗需經(jīng)過從無菌環(huán)境到有菌環(huán)境的轉(zhuǎn)變,保持濕度和避免強光輻射是煉苗過程中特別需要注意的問題,這對于苗的最終成活起著非常重要的作用,同時成活率的高低與它們在培養(yǎng)基中長出的不定根有直接的關(guān)系,許多學(xué)者也都注意到了這些問題[21-25]。本研究試管苗移栽成活率在80%以上,為進一步研究打下堅實的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

試驗以雜種 F1的莖段為外植體,篩選出MS+2,4-D 0.1 mg/L、6-BA 2 mg/L為適宜的誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基。繼代后將誘導(dǎo)形成的不定芽分別接入添加不同配比2,4-D、6-BA、KT、NAA的培養(yǎng)基中,最終得到MS+NAA0.5 mg/L、6-BA 1 mg/L、KT 1 mg/L為分化率最高的培養(yǎng)基。對生根培養(yǎng)基的選擇中,發(fā)現(xiàn)不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基為最佳的生根培養(yǎng)基。通過直接器官發(fā)生的途徑建立起雜種F1代擴繁體系,為恢復(fù)F1代的育性和加快回交速率做好了準備。

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