（北京林業(yè)大學(xué)草地資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083）

①苜蓿Medicago sativa是世界各國(guó)種植面積最多的牧草之一,在我國(guó)已有兩千多年的栽培歷史,屬豆科多年生優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)牧草,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,適應(yīng)性強(qiáng),適口性好,被譽(yù)為“牧草之王”。根蘗型苜蓿的根蘗性狀起源于西伯利亞地區(qū)的野生黃花苜蓿M.f alcata,該性狀能在水平根上形成根蘗,進(jìn)而形成枝條,形成較強(qiáng)的抗旱、耐嚴(yán)寒的能力,是極具利用價(jià)值的優(yōu)異遺傳性狀；探尋根蘗性狀發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制,尋找與根蘗性狀相關(guān)的新基因是國(guó)內(nèi)外研究的空白。尋找與根蘗性狀發(fā)生的相關(guān)基因,首先要進(jìn)行苜蓿cDNA的構(gòu)建,目前國(guó)內(nèi)有關(guān)苜蓿RNA的提取方法鮮有報(bào)道,因此,建立一種簡(jiǎn)便、高效適合苜?？俁NA的提取方法,是進(jìn)行根蘗苜蓿發(fā)生分子機(jī)制與新基因克隆的基礎(chǔ),也是進(jìn)行苜蓿基因組深入研究的關(guān)鍵。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1材料 根蘗型苜蓿為引自美國(guó)的Travois品種,取自北京順義區(qū)趙全營(yíng)鎮(zhèn)試驗(yàn)地,該地位于北京城區(qū)的東北方,屬暖溫帶半濕潤(rùn)氣候。于2009年8月生長(zhǎng)季將紫花苜蓿移栽回實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)前取紫花苜蓿的新鮮葉片、莖和根組織,用焦碳酸二乙脂（Diethyl Pyrocarbonate,DEPC）水迅速清洗2次,用濾紙吸干表面的水,迅速用液氮進(jìn)行研磨[1]。

1.1.2試劑和處理方法 所用試劑全部為新開(kāi)試劑,用滅菌的0.1%DEPC水配置；離心管、各種槍頭等塑料耗材均需預(yù)先用DEPC水浸泡過(guò)夜,次日于121℃高溫滅菌備用；研缽、研杵、藥匙、剪刀、試劑瓶等物品用錫箔紙包裹,于200℃高溫滅菌4 h[2]。

1.2 根蘗型苜蓿總RNA的提取方法

1.2.1改良CTAB法 根據(jù)劉君[3]的方法,作適當(dāng)修改。

1）取200 mg新鮮的紫花苜蓿材料放入預(yù)冷的研缽中,加入液氮,先輕輕研磨,在液氮即將揮發(fā)完時(shí),迅速研磨,再加液氮再研磨,直至將苜蓿材料研磨至粉末,轉(zhuǎn)入2 mL的離心管中。

2）在2 mL離心管中加入1 mL 65℃預(yù)熱的提取緩沖液[RNA提取緩沖液為 2%CTAB（m/V）、4%PVP（m/V）、0.1 mol/L Tris-Cl（pH值 8.0）、25 mmol/L EDTA-Na（pH 值8.0）、1.4 mol/L NaCl、使 用 前 加 入 1% β-巰 基 乙 醇（V/V）],渦旋1 min,65℃溫浴10 min,期間震蕩離心2～3次。

3）分別加入1.5 mL的酸性飽和酚（pH值4.7～5.5）和1.5 mL的氯仿∶異戊醇（24∶1）,充分震蕩,冰上放置10 min,4℃,12 000 r/min離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一新的2 mL離心管中,重復(fù)1次。

4）取1 mL上清液移入一個(gè)新的1.5 mL離心管中,加入250 μ L的10 mol/L LiCl混勻后,-20 ℃冰箱中放置3 h,4℃,12 000 r/min離心10 min。

5）棄上清液,加入100 μ L 0.5%SDS溶液溶解沉淀,同時(shí)加入10 μ L的3 mol/L NaAc（pH 值為5.2）,充分溶解后加220 μ L的預(yù)冷無(wú)水乙醇,混勻,于-70℃處理30 min,4℃,12 000 r/min離心15 min,去上清液。

6）用75%的乙醇洗滌沉淀2次,4℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清液,沉淀于室溫下風(fēng)干后加入80 μ L DEPC水充分溶解,放置-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2TRNzol法

1）取新鮮的紫花苜蓿材料在液氮中充分研磨,大約每100 mg使用 1 mL TRNzol。

2）將勻漿樣品在15～30℃放置5 min,使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3）可選步驟：4℃,12 000 r/min離心10 min,取上清液。

4）每使用1 mL TRNzol加入0.2 mL氯仿,蓋好管蓋,劇烈振蕩15 s,室溫放置3 min。注意：如不能旋渦混勻,可手動(dòng)快速顛倒混勻2 min。

5）4℃,12 000 r/min離心10～15 min,將上層水相（約600 μ L）轉(zhuǎn)移到新管中。

6）在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇,混勻,室溫放置20～30 min。

7）4℃,12 000 r/min離心10 min,去上清液。離心前 RNA沉淀經(jīng)常是看不見(jiàn)的,離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。

8）加入1 mL 75%乙醇（DEPC處理過(guò)的雙蒸水配制）洗滌沉淀。每使用1 mL T RNzol至少用1 mL 75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。

9）4℃,5 000 r/min離心3 min,倒出液體,注意不要倒出沉淀,剩余的少量液體短暫離心,然后用槍頭吸出,注意不要吸起沉淀。

10）室溫放置晾干（不要晾的過(guò)干,RNA完全干燥后會(huì)很難溶解,晾干2～3 min即可）,根據(jù)試驗(yàn)需要,加入40 μ L DEPC水,反復(fù)吹打,混勻,充分溶解RNA,放置-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3改良的異硫氰酸胍法 根據(jù)劉春生和王文全[4]的方法,作適當(dāng)修改。

1）取200 mg新鮮的紫花苜蓿材料在液氮中充分研磨,將粉末移入2 mL離心管中,加入在冰上預(yù)冷的800 μ L提取緩沖液[4 mol/L異硫氰酸胍、25 mmol/L檸檬酸鈉（pH 值7.0）、0.5%十二烷基肌氨酸鈉、8%PVP,用前加入1%β-巰基乙醇（V/V）]。

2）充分振蕩混勻,加入50 μ L 2 mol/L NaAc（pH 值4.2）和 50 μ L 氯仿∶異戊醇（24∶1）,充分混勻,冰浴15 min。

3）4℃,12 000 r/min離心20 min,將上清液移入新離心管,用等體積的氯仿：異戊醇（24∶1）抽提至界面清亮。

4）再將上清液移入新離心管,加入等體積的異丙醇,混勻,置-20℃沉淀2 h,4℃,12 000 r/min離心30 min。

5）小心移棄上清液,沉淀用500 μ L提取緩沖液重懸,同時(shí)加入1/10體積 3 mol/L NaAc（pH值5.2）和2.5倍體積的無(wú)水乙醇,-20℃放置2 h以上。4℃,12 000 r/min離心30 min,去上清液。

6）用75%乙醇洗沉淀2次,室溫下干燥,加入80 μ L DEPC水溶解沉淀。

1.2.4改良SDS法 根據(jù)史寶勝等[5]及何振艷等[6]的方法,作適當(dāng)修改。

1）取200 mg新鮮的紫花苜蓿材料在液氮中充分研磨,將粉末移入2 mL離心管中,向離心管中加入0.6 mL SDS提取緩沖液[2%（m/V）SDS、硼砂0.025 mol/L（pH值8.5）,DEPC水處理]、0.06 mL的β-巰基乙醇、0.4 mL Tris苯酚和0.3 mL氯仿,迅速加入離心管中,劇烈震蕩3 min。

2）4℃,12 000 r/min離心5 min,將上清液移入新離心管,加入0.3 mL Tris苯酚和0.3 mL氯仿,劇烈震蕩2 min,4℃,12 000 r/min離心5 min,將上清液移入新離心管,用等體積氯仿重復(fù)步驟2抽提1次。

3）向上清液中加入等體積的4 mol/L LiCl和1/2體積的無(wú)水乙醇,混勻,冰浴10 min,4℃,12 000 r/min離心10 min。

5）沉淀溶于適量的DEPC水中,待溶解后加入1/10體積2 mol/L NaAc和3倍體積無(wú)水乙醇,冰浴10 min,4℃,12 000 r/min離心10 min。

6）用 75%的乙醇洗滌沉淀1次,加入 80 μ L DEPC水溶解沉淀。

1.3RNA純度及其完整性檢測(cè)用1.2%瓊能量系統(tǒng)脂糖凝膠在50×TAE緩沖液下電泳,電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。取3 μ L RNA 樣品,用DEPC 水稀釋到 300 μ L,混勻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定230、260和280 nm波長(zhǎng)下的吸收值,進(jìn)行總RNA質(zhì)量濃度計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法下苜蓿總RNA產(chǎn)率與純度分析由表1可見(jiàn),采用改良CTAB法和T RNzol試劑盒法提取的總 RNA 其OD260 nm/OD280 nm為 1.66～1.89,OD260nm/OD230nm為1.98～2.34,說(shuō)明通過(guò)這2種方法得到的總RNA的產(chǎn)率和純度都比較高,有效去除了蛋白、多糖和酚類(lèi)等物質(zhì),減少了RNA的降解和損失,明顯優(yōu)于其他 2種方法提取的總 RNA,改良CTAB法與 TRNzol試劑盒法相比,總 RNA的純度與產(chǎn)率都明顯較高,是更適合提取苜蓿總RNA的方法。

改良SDS法和改良異硫氰酸胍法提取的總RNA其 OD260 nm/OD280nm過(guò)大或過(guò)小。比值過(guò)大,說(shuō)明RNA有降解；比值過(guò)小,則說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)或酚類(lèi)存在。OD260 nm/OD230nm小于2.0,表明其中有大量的小分子或鹽存在,因而這2種方法所得RNA需進(jìn)一步純化。

2.2 不同提取方法下苜蓿總RNA的完整性比較分析4種方法下提取的苜蓿根、莖、葉總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示,用CTAB法和T RNzol試劑盒法提取的總 RNA,28S rRNA和18S rRNA和5S rRNA 3條帶型清晰、整齊,很少有降解（用葉組織提取的總 RNA存在部分蛋白質(zhì)污染）,總RNA的28S rRNA亮度約為18S rRNA的2倍,同時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DNA的污染；改良SDS法和改良異硫氰酸胍法提取的總RNA有28S rRNA 、18S rRNA 2條帶,但亮度較差,帶型不清晰,說(shuō)明RNA產(chǎn)率很少且存在嚴(yán)重降解和帶型彌散,可能是因?yàn)椴僮鞯臅r(shí)間較長(zhǎng)導(dǎo)致,不適合苜?？?RNA的提取。從電泳圖來(lái)看,CTAB法最適合苜?？俁NA的提取。

本研究進(jìn)一步對(duì)改良CTAB法和TRNzol試劑盒法下提取的總RNA進(jìn)行凝膠電泳比較,結(jié)果如圖2所示,改良CTAB法提取的效果最好,可以進(jìn)行下一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),而T RNzol試劑盒法存在部分蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染,雖然操作簡(jiǎn)便、省時(shí),但使用前需要進(jìn)一步純化。

圖1 不同方法下苜?？俁NA（根、莖、葉）的凝膠電泳

圖2 2種方法下苜?？俁NA（根、莖、葉）的凝膠電泳

3 討論與結(jié)論

3.1獲得純度高、完整性好的RNA是構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫(kù)、進(jìn)行基因表達(dá)和功能鑒定等研究的前提[7]。苜蓿在生長(zhǎng)過(guò)程中因生長(zhǎng)環(huán)境脅迫而有著復(fù)雜的次生代謝,積累了大量的次生代謝物質(zhì),如多糖、異黃酮和皂甙類(lèi)等小分子物質(zhì)[8-9],它們?nèi)菀着cRNA共沉淀,對(duì)RNA的提取和純化有干擾作用,從而影響總RNA的產(chǎn)率和純度。因此,要獲得完整和高純度的 RNA是一項(xiàng)較為困難的工作。在改良CTAB法中加入酸性水飽和酚,可有效去除DNA污染,因?yàn)樵谒嵝詶l件下,DNA一般存在于中間層（與蛋白和糖等共沉淀）或者在上層上清液中,盡量取最上層上清液可以有效去除 DNA雜質(zhì)[10]；本研究加入 3 mol/L NaAc（pH值為5.2）和預(yù)冷無(wú)水乙醇,可以有效去除微量Li+和Cl-,減少它們對(duì)RNA反轉(zhuǎn)錄和體外翻譯的干擾；如果在改良CTAB法中采用7 mL離心管,可增加材料的使用量,更好地在轉(zhuǎn)移足夠的上清液時(shí)避免DNA污染；在提取過(guò)程當(dāng)中直接加入飽和酚和氯仿異戊醇,減少了轉(zhuǎn)移次數(shù),避免了RNA酶的污染,為獲得較高產(chǎn)率的苜蓿總RNA提供了保證[11]。

3.2改良CTAB法優(yōu)點(diǎn)是成本低廉,且能夠有效地去除樣品中的蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì),提取的RNA完整性好、純度高；但步驟繁瑣,有毒藥品和試劑多,對(duì)人體影響大,而且要用 LiCl和飽和酚進(jìn)行多次沉淀,進(jìn)一步延長(zhǎng)了抽提時(shí)間。TRNzol試劑盒法一步提取,快速簡(jiǎn)捷,所需試劑種類(lèi)少,提取的RNA純度和完整性均較好,缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴,且只適于少量樣品的提取,所得的RNA比較有限,不適合對(duì)RNA需求量大的研究[12]。本研究還發(fā)現(xiàn),用T RNzol試劑盒提取RNA時(shí),苜蓿的根和莖明顯優(yōu)于葉。改良SDS法和改良異硫氰酸胍法是從真核細(xì)胞中提取總RNA的常用方法,在許多植物中均可分離到高質(zhì)量的RNA。但本研究發(fā)現(xiàn),這2種方法不能有效地去除苜蓿樣品中的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì),且均存在明顯的降解和彌散現(xiàn)象,不適合苜?？俁NA的提取。

3.3苜?？剐陨砗头肿由飳W(xué)機(jī)制[13]、再生體系及基因工程[14-15]研究在苜蓿育種中起了重要作用,隨著苜?；蚪M研究的興起,提取完整性好、純度高的高品質(zhì)苜?？俁NA,是開(kāi)展苜蓿基因表達(dá)調(diào)控、抗性分子機(jī)制以及新基因挖掘等相關(guān)研究的前提,本研究針對(duì)根蘗型苜蓿高效RNA提取方法的總結(jié),將為與苜蓿根蘗等優(yōu)良性狀相關(guān)的新基因克隆提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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