叢艷君， 任發(fā)政， 云戰(zhàn)友

(1. 北京工商大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 北京 100048; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083; 3. 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010080)

乳及乳制品是FAO/WHO認(rèn)定的導(dǎo)致人類(lèi)食物過(guò)敏的8大類(lèi)食品之一，β-乳球蛋白是引起牛乳過(guò)敏的主要過(guò)敏原[1-2]. 食物過(guò)敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)是過(guò)敏原抗原決定簇(作用表位)的存在，即過(guò)敏原參與結(jié)合抗體的組成部分[3]. 牛乳過(guò)敏原的表位是備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一，研究成果可以指導(dǎo)無(wú)過(guò)敏和低過(guò)敏的乳制品的開(kāi)發(fā).

食物過(guò)敏反應(yīng)一般是由免疫球蛋白IgE介導(dǎo)的，但是一些研究表明，免疫球蛋白IgG在牛奶過(guò)敏疾病中發(fā)揮重要的作用. IgG介導(dǎo)牛奶過(guò)敏的機(jī)制還不是很清楚，但是研究發(fā)現(xiàn)在一些持續(xù)性牛乳過(guò)敏患兒和成人患者血清中抗乳蛋白的IgG含量顯著高于正常水平[4-6].

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用固相合成肽的方法合成β-乳球蛋白多肽，以收集到的牛乳過(guò)敏患者血清中的IgG為探針，鑒定β-乳球蛋白IgG抗原決定簇，探討牛乳過(guò)敏機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-乳球蛋白多肽，實(shí)驗(yàn)室合成；鏈霉親和素(Streptavidin,SA)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗人IgG(二抗)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，美國(guó)Sigma公司；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，美國(guó)Costar公司.

1.2 儀器與設(shè)備

BIO-RAD550型酶標(biāo)儀，BIO-RAD公司；PSH500A生化培養(yǎng)箱，中國(guó)重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；F-32酸度劑，日本崛廠制作公司；Th-80D-2B型凍干機(jī)，北京天地精儀科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成[7]

采用Fmoc固相肽合成法，將C-末端氨基酸連接到一種合適的固相載體上，采用常規(guī)Fmoc法進(jìn)行逐步縮合，合成結(jié)束后，用強(qiáng)酸將序列從固相載體上切割下來(lái)，經(jīng)HPLC純化，冷凍干燥后備用.

1.3.2 合成肽的純化和鑒定

合成的多肽用高效液相色譜進(jìn)行純化，多肽的純度用質(zhì)譜進(jìn)行分析. 色譜柱： C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA的水溶液，B為15%～40%的乙腈, 梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，柱溫：20 ℃. 質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，噴霧壓力0.1 MPa，干燥氣溫度350 ℃，流速5 L/min，掃描質(zhì)量范圍：500～2 200 m/z.

1.3.3 牛奶過(guò)敏患者血清的收集

6份牛乳過(guò)敏患者血清用來(lái)識(shí)別β-乳球蛋白IgG抗原決定簇，以A-F表示.

1.3.4 酶聯(lián)免疫(ELISA)識(shí)別抗原決定簇

合成肽致敏性的檢測(cè)是在96孔微板上進(jìn)行的，每孔均先用鏈霉親和素包被，分別依次加入待進(jìn)行抗原決定簇鑒定的肽系列，再用抗體檢測(cè)[8].

操作步驟如下：

1) 凍干的肽溶于體積分?jǐn)?shù)為100%二甲基亞砜(DMSO)中，使其貯存液的質(zhì)量濃度為10 g/L，工作液的終質(zhì)量濃度為1 g/L，貯存于-70 ℃.

2) 用質(zhì)量濃度為5 mg/L鏈霉親和素(去離子水稀釋)包被96孔板每孔50 μL.

3) 用0.1%PBS-Tween(0.05%)洗板4次，用質(zhì)量濃度為20 g/L的BSA/PBS封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫2 h.

4) 將肽用質(zhì)量濃度為1 g/L BSA/PBS稀釋至終質(zhì)量濃度為20 mg/L，每孔加入50 μL肽溶液，4 ℃孵育過(guò)夜，未加肽溶液的孔作為對(duì)照組.

5) 加入用質(zhì)量濃度為1 g/L的BSA/PBS稀釋4倍的牛奶過(guò)敏患者血清孵育2 h.

6) 吸去抗體溶液，用洗滌液洗板4次，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(用BSA/PBS作1/800稀釋)，孵育2 h.

7) 洗板4次，加入TMB底物，每孔50 μL，出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)(30 min)，加入濃度為100 mmoL/L硫酸50 μL終止反應(yīng). 在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)其光密值(OD值).

2 結(jié)果與討論

2.1 合成肽

以β-乳球蛋白氨基酸序列為模板，用Fmoc固相合成法錯(cuò)位合成β-乳球蛋白30條，結(jié)果如表1.

2.2 合成肽的純度鑒定

合成的多肽通過(guò)高效液相純化，純度都達(dá)到了80%以上，進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜鑒定多肽的相對(duì)分子質(zhì)量(加上生物素的相對(duì)分子質(zhì)量)，表明多肽相對(duì)分子質(zhì)量誤差均小于5%. 本實(shí)驗(yàn)代表性的附上了兩條多肽(偶聯(lián)生物素)的質(zhì)譜圖，如圖1、圖2.

2.3 IgG抗原決定簇的識(shí)別

圖3為A牛乳過(guò)敏患者識(shí)別β-乳球蛋白IgG抗原決定簇. 由圖3可以看出，A患者識(shí)別到的抗原決定簇為B01,B02,B06,B10,B15,B22,B27,B28.

表1 合成肽氨基酸序列

圖1 生物素標(biāo)記多肽(Biotin-LIVTQTMKGLDIQKV) 的質(zhì)譜圖Fig.1 MS profile of the peptide with the sequence of LIVTQTMKGLDIQKV coupling biotin

圖2 生物素標(biāo)記多肽(Biotin-TKIPAVFKIDALNEN) 的質(zhì)譜圖Fig.2 MS profile of the peptide with the sequence of TKIPAVFKIDALNEN coupling biotin

圖3 A牛乳過(guò)敏患者血清識(shí)別β-乳球蛋白IgG 抗原決定簇Fig.3 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from A cow milk allergenic patient

圖4為B牛乳過(guò)敏患者識(shí)別β-乳球蛋白IgG抗原決定簇. 如圖4，B患者識(shí)別到抗原決定簇為B03,B06,B12,B18,B23.

圖4 B牛乳過(guò)敏患者血清識(shí)別β-乳球蛋白 IgG抗原決定簇Fig.4 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from B cow milk allergenic patient

由圖5可知，C患者識(shí)別到抗原決定簇為B02,B08,B16,B23.

圖5 C牛乳過(guò)敏患者血清識(shí)別β-乳球蛋白IgG 抗原決定簇Fig.5 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from C cow milk allergenic patient

圖6為D牛乳過(guò)敏患者識(shí)別β-乳球蛋白IgG抗原決定簇. 由圖6可以看出，D患者識(shí)別到抗原決定簇為B02,B12,B23,B30.

圖6 D牛乳過(guò)敏患者血清識(shí)別β-乳球蛋白IgG 抗原決定簇Fig.6 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from D cow milk allergenic patient

由圖7可知，E患者識(shí)別到抗原決定簇為B02,B06,B12,B23,B28.

圖7 E牛乳過(guò)敏患者血清識(shí)別β-乳球蛋白IgG 抗原決定簇Fig.7 Identification of the immunodominant β-lactoglobulin epitopes with sera from E cow milk allergenic patient

圖8為F牛乳過(guò)敏患者識(shí)別β-乳球蛋白IgG抗原決定簇. 由圖8可知，F(xiàn)患者識(shí)別到的抗原決定簇為B02,B26.

由圖3～圖8可知，6位牛乳過(guò)敏患者識(shí)別的β-乳球蛋白IgG作用表位的結(jié)果差異較大，以6位牛乳過(guò)敏患者全部識(shí)別到的結(jié)果為100%，則牛乳過(guò)敏患者對(duì)編號(hào)B02多肽的識(shí)別率為83.3%(5/6)，對(duì)B23的識(shí)別率為66.7%(4/6)，B06，B12的識(shí)別率為50%(3/6)，B28的識(shí)別率為30%(2/6)，B01，B08，B10，B15，B16，B18，B22，B26，B27，B30的識(shí)別率為16.7%(1/6). B02，B23的識(shí)別率在60%以上，為研究β-乳球蛋白IgG抗原決定簇，其氨基酸序列為T(mén)MKGLDIQKVAGTWY, AEPEQSLACQCLVRT,它們?cè)谌榍虻鞍字械陌被嵝蛄卸ㄎ环謩e為aa22-36, aa127-141，如表2劃?rùn)M線(xiàn)部分. 用非牛乳過(guò)敏患者血清識(shí)別抗原決定簇的結(jié)果作陰性對(duì)照，其吸光度值均低于0.1(本論文未附具體數(shù)據(jù)).

表2 抗原決定簇在β-乳球蛋白氨基酸序列中的定位

3 結(jié)論與展望

目前對(duì)β-乳球蛋白IgG表位的研究較少，只確定了6個(gè)識(shí)別位點(diǎn)：肽鏈1-16位，51-64位，67-88位，85-96位，129-144位，139-156位，其中1-16位和58-96位為次要識(shí)別位點(diǎn)，其余為主要識(shí)別位點(diǎn)[9-10]. 本研究識(shí)別到的抗原決定簇aa127-141與肽鏈129-144位是一致的，抗原決定簇aa22-36是以前沒(méi)有報(bào)道過(guò)的. 由于收集牛乳過(guò)敏患者血清的困難性及所需時(shí)間的長(zhǎng)期性，本研究只是進(jìn)行階段性探索，今后將繼續(xù)開(kāi)展這方面工作.

IgG介導(dǎo)牛乳過(guò)敏的機(jī)制還不是很清楚，開(kāi)展IgG抗原決定簇識(shí)別工作是個(gè)重要的突破口. β-乳球蛋白大多數(shù)IgG作用表位是IgE作用表位的片段，雖然IgG與這些表位的結(jié)合能力較低能夠解釋這種現(xiàn)象，但是更重要的原因是產(chǎn)生IgG的抗原決定簇可能不同于產(chǎn)生IgE的[10]. 更有研究表明：IgG主要識(shí)別構(gòu)象抗原決定簇，而正常人血清既可以識(shí)別構(gòu)象抗原決定簇又可識(shí)別線(xiàn)性決定簇[11]，這方面有待于深入研究，也是未來(lái)研究工作的重點(diǎn). 另外發(fā)現(xiàn)，一些牛乳過(guò)敏患兒3～4歲之后，會(huì)發(fā)生免疫耐受，血清中IgG4含量明顯升高[12],這為牛乳過(guò)敏的臨床治療提供了思路，而本研究識(shí)別到的IgG作用表位可為診治探針的制備提供理論依據(jù).