考夫曼 等

引言

基于抗原的治療策略（ABTs）是通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答（主動(dòng)耐受）或降低/消除病理性T細(xì)胞效應(yīng)（被動(dòng)耐受），以達(dá)到預(yù)防或抑制自身免疫性疾病的目的。理論上，這種治療方法可以促進(jìn)免疫耐受且對(duì)免疫系統(tǒng)功能影響有較小影響。臨床上應(yīng)用ABTs治療自身免疫性疾病尚處于初級(jí)階段。盡管最初應(yīng)用ABTs治療多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及1型糖尿病時(shí)的療效并不理想、但最近的臨床研究結(jié)果提示ABTs有希望延緩1型糖尿病的發(fā)病，保護(hù)成人隱匿性自身免疫性糖尿?。↙ADA）及新診斷的兒童1型糖尿病患者的胰島β細(xì)胞功能。若此結(jié)果被證實(shí)，ABTs將實(shí)現(xiàn)由NOD鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)到臨床應(yīng)用的重要轉(zhuǎn)化。然而，NOD鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明，ABTs帶來(lái)的免疫學(xué)影響比之前預(yù)計(jì)的要更多變和復(fù)雜得多。關(guān)于嚙齒類動(dòng)物和人類在1型糖尿病發(fā)病機(jī)制上的差別及其他免疫治療方法在之前發(fā)表的文章中已有全面綜述，在此，我們僅以ABTs為中心，討論其免疫性影響，理論上可影響其療效和安全性的因素，以及有希望用于評(píng)價(jià)其療效的標(biāo)記物。

針對(duì)β細(xì)胞抗原的炎癥性T細(xì)胞反應(yīng)在鼠科和人類1型糖尿病發(fā)展中廣泛存在

1型糖尿病是由自身反應(yīng)性T細(xì)胞識(shí)別β細(xì)胞自身抗原(β- CAAs)所介導(dǎo)的。在NOD鼠中，自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞主要是Th1型（分泌干擾素γ），隨著病程發(fā)展，自身免疫反應(yīng)逐漸擴(kuò)展到β- CAAs分子內(nèi)和分子間，如胰島素、GAD、熱休克蛋白（HSP）、IGRP等。同樣，自發(fā)性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答亦擴(kuò)展到如胰島素、GAD、IGRP等其他β- CAAs。與在NOD小鼠的觀察相似，在人類1型糖尿病患者中，針對(duì)許多β-CAAs自身反應(yīng)性CD4+（主要是Th1）和 CD8+T細(xì)胞亦有上升。這種擴(kuò)散的炎癥性T細(xì)胞反應(yīng)將引起促炎瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而推動(dòng)疾病的進(jìn)一步發(fā)展。

圖1

ABT介導(dǎo)的主動(dòng)耐受

給予自身抗原能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)，如Th2 (分 泌 白 介 素 [IL]：IL-4和 IL-5)、 Th3(分泌TGFβ)及Tr1 (分泌IL-10)，以及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (分泌IL-10 和TGFβ)的應(yīng)答，從而抑制促炎性的Th1 和Th17反應(yīng)，以在動(dòng)物模型中阻止1型糖尿病、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及葡萄膜炎等發(fā)生。誘導(dǎo)這種主動(dòng)耐受無(wú)需起始目標(biāo)抗原或效應(yīng)T細(xì)胞特異性信息。當(dāng)治療介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞識(shí)別炎癥反應(yīng)部位的抗原時(shí)，將釋放抗炎因子以抑制局部效應(yīng)T細(xì)胞的作用，這種旁觀者抑制（bystander suppression）的作用不具有特異性。盡管炎癥型自身反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答持續(xù)存在，ABT介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性應(yīng)答能建立組織特異性的長(zhǎng)期的功能性耐受而不削弱其免疫力。

ABTs不僅可誘導(dǎo)針對(duì)給定自身抗原的免疫應(yīng)答，還能產(chǎn)生針對(duì)其他靶組織自身抗原的免疫反應(yīng)。例如，NOD鼠經(jīng)單個(gè)β- CAA和不完全弗氏佐劑（IFA）聯(lián)合處理后，可產(chǎn)生注射的自身抗原以及其他檢測(cè)的β細(xì)胞自身抗原的Th2應(yīng)答。這種調(diào)節(jié)性應(yīng)答的擴(kuò)散僅限于β- CAA目標(biāo)決定簇，而不會(huì)發(fā)生在野生型小鼠。在器官移植后和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，亦可觀察到由ABT介導(dǎo)的Tr1和Treg應(yīng)答擴(kuò)散。因此，與炎癥反應(yīng)相似，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)亦可擴(kuò)展，可能是通過(guò)分泌細(xì)胞因子和作用于抗原遞呈細(xì)胞（APCs）推動(dòng)相似T細(xì)胞應(yīng)答的活化或擴(kuò)展。

這種由ABT介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性應(yīng)答可廣泛和快速的擴(kuò)散。例如，經(jīng)IFA聯(lián)合單個(gè)β- CAA免疫處理的新生NOD小鼠，在4周齡時(shí)，針對(duì)所有檢測(cè)β- CAA的Th2型細(xì)胞自身免疫反應(yīng)在脾臟均可出現(xiàn)，這與在未經(jīng)處理的NOD小鼠中最早檢測(cè)出β- CAA自身應(yīng)答時(shí)間相比要早得多。有證據(jù)顯示，在發(fā)生胰島炎之前，NOD鼠體內(nèi)即存在β- CAA反應(yīng)性T細(xì)胞，給予有效協(xié)同信號(hào)，后者可迅速激活和/或擴(kuò)散。由于Th2應(yīng)答可擴(kuò)展至所有檢測(cè)的β- CAA目標(biāo)決定簇，因此，擴(kuò)散的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答數(shù)目可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)針對(duì)給予β- CAA自身的數(shù)目。

除了增加旁觀者抑制作用外，擴(kuò)展的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答能減少可致病性未接觸抗原刺激的效應(yīng)型T細(xì)胞群。此外，其分泌的抗炎因子能誘導(dǎo)耐受性APCs，從而進(jìn)一步促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答。這些協(xié)同作用可能是ABT具保護(hù)作用的基礎(chǔ)。

影響NOD小鼠ABTs療效的因素

抗原大小

小分子抗原可能僅包含一個(gè)抗原決定簇，因而只能由一個(gè)特定的主要組織相容性符合體（MHC）遞呈，而一個(gè)大分子蛋白質(zhì)包含很多決定簇，由各個(gè)MHC等位基因遞呈。因此，ABTs中使用的抗原大小影響其誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的程度。事實(shí)上，是GAD而非胰島素β鏈或HSPp277接種疫苗延長(zhǎng)了糖尿病NOD鼠同系胰島移植后的存活，且在NOD小鼠治療中，聯(lián)合GAD多肽段比單個(gè)多肽預(yù)防疾病更有效。

抗原表達(dá)形式

由于各個(gè)自身蛋白表達(dá)形式不同，因此，無(wú)論是其誘導(dǎo)的外周和中樞耐受還是留守細(xì)胞庫(kù)的抗原特異性（同源）T細(xì)胞數(shù)量和活性均存在差異。人類胸腺中所表達(dá)的胰島素原水平，是受1型糖尿病易感基因多態(tài)性調(diào)節(jié)的。NOD小鼠胸腺表達(dá)胰島素原2而非胰島素原1 ，敲除胰島素原2基因?qū)⒓铀偌膊“l(fā)展過(guò)程。GAD65基因能否轉(zhuǎn)染到NOD鼠胸腺中表達(dá)尚有爭(zhēng)議，但胸腺中尚未檢測(cè)出GAD酶活性(D.L.K.,未發(fā)表數(shù)據(jù))。GADs在神經(jīng)元中表達(dá)較少。盡管GAD65在鼠β細(xì)胞中表達(dá)水平極低，但已經(jīng)足夠?qū)е翯AD65特異性CD8+T細(xì)胞克隆迅速摧毀NOD/SCID鼠的β細(xì)胞。GAD在組織的低表達(dá)可能是由于較少的陰性選擇，使得自身免疫前的NOD小鼠中存在大量高親和力的未活化GAD65-反應(yīng)性 T細(xì)胞。未活化抗原特異性T細(xì)胞群的大小和活性在很大程度上決定了抗原調(diào)節(jié)應(yīng)答的能力。

疾病發(fā)展的階段

盡管在NOD鼠早期階段給予ABTs十分有效，但隨著自身免疫病程進(jìn)展，其有效性降低。外來(lái)抗原和非β細(xì)胞自身抗原在NOD小鼠中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力不受疾病進(jìn)程的影響（圖1A）。與之相反，對(duì)于所有β- CAAs及包含β- CAAs抗原決定簇的肽段，其原有的Th2免疫及擴(kuò)散能力隨病程進(jìn)展顯著降低（圖1B）。這種β-CAAs誘導(dǎo)調(diào)節(jié)應(yīng)答能力的衰減，有可能反映了未活化β- CAA反應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)行性招募到病理性應(yīng)答中而降低了被ABT預(yù)處理的同源幼稚T細(xì)胞有效性。

NOD小鼠發(fā)展為輕度高血糖癥后，ABTs對(duì)于減慢疾病進(jìn)程的作用微乎其微。NOD小鼠通常在1～2周內(nèi)從輕度進(jìn)展至重度高血糖癥，而ABTs需10～14天方能誘導(dǎo)針對(duì)給予的β-CAA最大免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)于擴(kuò)展至其他β- CAAs的應(yīng)答則需要更長(zhǎng)的時(shí)間。當(dāng)ABT誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)應(yīng)答達(dá)峰值時(shí)，殘留的β細(xì)胞群已不足。與此相反，抗CD3及其它系統(tǒng)性免疫抑制劑可迅速起效，能在新發(fā)糖尿病的NOD小鼠中逆轉(zhuǎn)高血糖癥。即使用抗CD3治療NOD小鼠，其血糖水平超過(guò)400 mg/dl之前有效。這意味著足夠的殘存β細(xì)胞是治療有效的基礎(chǔ)，此結(jié)論來(lái)自抗CD3和GAD疫苗的臨床試驗(yàn)結(jié)果。

盡管ABTs并不能有效逆轉(zhuǎn)NOD小鼠的高血糖癥，但ABTs可延長(zhǎng)NOD小鼠同系胰島移植物的存活，這表明ABTs能誘導(dǎo)1型糖尿病起病后的潛在性調(diào)節(jié)應(yīng)答。在這些研究中，給予了患糖尿病的NOD小鼠ABT，且持續(xù)用胰島素治療，數(shù)周后再移植同系胰島，從而為誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性應(yīng)答爭(zhēng)取了充足的時(shí)間。GAD而非胰島素β鏈或HSPp277的疫苗能延長(zhǎng)胰島移植物的存活。這可能反映了GAD具有較大的體積，眾多的免疫原性決定簇及在NOD小鼠疾病晚期更好的免疫原性。此外，ABT介導(dǎo)的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)大小是一個(gè)重要因素。這些發(fā)現(xiàn)提示在疾病晚期，調(diào)節(jié)性應(yīng)答可能是經(jīng)擁有大量可供啟動(dòng)的未分化同源T細(xì)胞池的靶組織抗原而得到最好的篩選。

被識(shí)別與被忽略的β細(xì)胞抗原

ABTs著眼于給予自身抗原本身。但由于β-CAAs預(yù)備免疫應(yīng)答的能力隨疾病進(jìn)程減弱，而從未參與至自身免疫過(guò)程中的β細(xì)胞抗原基于其免疫原性，能在晚期病程的NOD小鼠中更有效地預(yù)防疾病(圖1-3)。但是ABTs誘導(dǎo)的這種新自身免疫或許有不可預(yù)料的危險(xiǎn)。同樣，包含β-CAA目標(biāo)決定簇的合成肽其免疫原性也變?nèi)酰挥谕沪? CAA內(nèi)被自身免疫過(guò)程所忽略的決定簇，其免疫原性并未受到疾病進(jìn)程的影響(圖1C)。由于完全隱藏的決定簇很少?gòu)恼w抗原中遞呈出來(lái)且其對(duì)T細(xì)胞分泌的影響性小，因此，通過(guò)使用含決定簇的合成多肽（其可繞開(kāi)整個(gè)抗原過(guò)程）治療，使病程后期有可供使用的大量同源T細(xì)胞。

對(duì)12周齡的NOD小鼠接種完全隱藏決定簇的疫苗，可產(chǎn)生更強(qiáng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答，且能比接種β- CAAs主要目標(biāo)決定簇疫苗更有效的預(yù)防1型糖尿病(圖1和圖2)。被識(shí)別和被忽略抗原決定簇的免疫原性，誘導(dǎo)的Th2應(yīng)答幅度均與其預(yù)防NOD小鼠1型糖尿病發(fā)生的能力正相關(guān)（圖3)。這些觀察結(jié)果提示將較大抗原片段化（如通過(guò)肽鏈內(nèi)切酶或使用一系列合成多肽）可能暴露大量隱藏決定簇且能比整體自身抗原預(yù)備更多調(diào)節(jié)性應(yīng)答。誘導(dǎo)對(duì)完全隱藏β- CAA決定簇的調(diào)節(jié)性應(yīng)答可能是較安全的，因?yàn)椋?)調(diào)節(jié)性自身反應(yīng)性擴(kuò)散如經(jīng)典ABTs之后一樣，僅在β-CAA目標(biāo)決定簇間發(fā)生。2) 由于同源T細(xì)胞在活體中并未活化，此誘導(dǎo)較難促進(jìn)病理性T細(xì)胞應(yīng)答。在腫瘤疫苗領(lǐng)域，使用隱藏決定簇進(jìn)行免疫，在小鼠中能比顯性腫瘤抗原決定簇誘導(dǎo)出更多更高親和力的T細(xì)胞應(yīng)答，使用隱藏腫瘤抗原決定簇的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。

先前的免疫史影響后續(xù)免疫反應(yīng)

先前存在于小鼠中的Th1應(yīng)答能修飾Th2促進(jìn)佐劑中其他靶抗原的后續(xù)免疫反應(yīng)。這種調(diào)整可能是由第一輪效應(yīng)和記憶細(xì)胞或APCs培育的細(xì)胞因子所致。兒童注射芽孢桿菌卡介苗疫苗能降低過(guò)敏性疾病發(fā)病率，提示個(gè)體先前的免疫應(yīng)答影響后續(xù)反應(yīng)。有趣的是，接種GAD/明礬（GAD/alum）疫苗(20 μg)并不增加緩慢進(jìn)展型1型糖尿病——LADA患者的GAD自身抗體(表1)，但可大量增加新發(fā)糖尿病患兒的GAD自身抗體，這提示自身免疫反應(yīng)的進(jìn)展性影響對(duì)ABT的免疫應(yīng)答（見(jiàn)下）。若先前存在的自身免疫反應(yīng)可調(diào)節(jié)ABT誘導(dǎo)的應(yīng)答，則其可用于減少先于ABT的病理性應(yīng)答，共同管理有助于增強(qiáng)調(diào)節(jié)應(yīng)答誘導(dǎo)的因子（如細(xì)胞因子），優(yōu)化ABT在自身免疫過(guò)程不同階段的劑量和頻率。

ABT的劑量和途徑

皮下給予可溶性自身抗原通常只能產(chǎn)生微弱的免疫原性，但重復(fù)治療能很好的調(diào)節(jié)應(yīng)答。粘膜給藥途徑證實(shí)產(chǎn)生了調(diào)節(jié)性應(yīng)答。吸入抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答比口服抗原更為有效。誘導(dǎo)較強(qiáng)自身抗原應(yīng)答的最有效方法是將其加入佐劑中。加入佐劑的免疫原提供的抗原作用持久，且能促進(jìn)活體耐受性T細(xì)胞和APCs長(zhǎng)期存在于活體中。然而，更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答本身具有誘導(dǎo)更多不希望發(fā)生的應(yīng)答的危險(xiǎn)。

表達(dá)β- CAA 的DNA載體是穩(wěn)定的且能共運(yùn)載其他基因編碼的免疫調(diào)節(jié)蛋白。因DNA中結(jié)合Toll樣受體的二核苷酸（CpG）基序起促炎佐劑的作用，免疫調(diào)節(jié)基因的共運(yùn)載可能為推動(dòng)功能性顯性調(diào)節(jié)應(yīng)答所必需。

圖2 使用對(duì)照(A), 靶抗原(B)或忽略抗原(C)免疫后的NOD小鼠中1型糖尿病發(fā)生率

圖3 β- CAA可供NOD小鼠應(yīng)答的能力與治療效能的關(guān)系

表1 詞匯表

ABT的劑量和使用頻率對(duì)人類進(jìn)行中的自身免疫的效果僅剛剛開(kāi)始研究，其仍然是發(fā)展ABTs的瓶頸所在。我們假設(shè)ABTs能喚起包括誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，推進(jìn)病理性應(yīng)答，致使T細(xì)胞衰竭、無(wú)能乃至刪除的混合性免疫應(yīng)答。這些應(yīng)答的程度可能依賴于治療的劑量、途徑和頻率。ABT所引起的混合性應(yīng)答也許能解釋為何口服不同胰島素劑量，在新發(fā)1型糖尿病患者的小范圍臨床試驗(yàn)中其結(jié)果多變，為何LADA患者使用GAD/明礬疫苗，其收益只限于特定的劑量，且并不表現(xiàn)出劑量依賴性，以及為何用GAD/明礬治療新發(fā)1型糖尿病患者，細(xì)胞因子對(duì)GAD的應(yīng)答表現(xiàn)出明顯的多樣化（如下）。

被動(dòng)耐受

ABTs能通過(guò)降低或消除T細(xì)胞反應(yīng)而誘導(dǎo)被動(dòng)耐受。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，亦可通過(guò)抑制自身抗原表達(dá)或消除自身抗原的目標(biāo)決定簇而誘導(dǎo)被動(dòng)耐受。胰島素和GAD的被動(dòng)耐受能預(yù)防NOD小鼠胰島炎和1型糖尿病的發(fā)展。這些觀察結(jié)果可能初步明確了β細(xì)胞自身抗原或表明自身反應(yīng)性是自身免疫應(yīng)答所必需的驅(qū)動(dòng)劑，若缺乏，其他的幼稚自身免疫反應(yīng)性將被活化誘導(dǎo)為細(xì)胞死亡或調(diào)節(jié)。大部分對(duì)GAD被動(dòng)耐受的轉(zhuǎn)基因NOD小鼠，起初T細(xì)胞對(duì)其他β- CAAs的應(yīng)答有顯著的降低，表明早期T細(xì)胞自身反應(yīng)性需要相互支持才能擴(kuò)展(J.T.，D.L.K.，未發(fā)表數(shù)據(jù))。隨著小鼠長(zhǎng)大，它們對(duì)其他β- CAAs具超常的T細(xì)胞應(yīng)答，如此以致疾病的發(fā)生率并不能降低。降低或消除許多GAD反應(yīng)性T細(xì)胞效應(yīng)將使其他β- CAA反應(yīng)性T細(xì)胞最終擴(kuò)大到極限，這可能是由于降低了APCs的競(jìng)爭(zhēng)或在靶組織中有恒定增殖所導(dǎo)致的。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了將原T細(xì)胞類型庫(kù)轉(zhuǎn)化為僅針對(duì)單一自身抗原后，自身免疫應(yīng)答所具的動(dòng)態(tài)特征及潛在的預(yù)期外結(jié)果。

在人類1型糖尿病中是否存在初始抗原尚不清楚。中樞和外周誘導(dǎo)機(jī)制僅能使T細(xì)胞和β-CAAs在亞活化閾值時(shí)發(fā)生相互作用。理論上，當(dāng)抗原遞呈因胰島重塑、代謝需要或局部炎癥受到干擾時(shí)，之前和活化閾值之下同源β- CAAs相互作用的T細(xì)胞（對(duì)多數(shù)β- CAAs有反應(yīng)）將得到充分的刺激以激活和擴(kuò)展，這將引發(fā)多種起始抗原的自身耐受。除非已有關(guān)鍵因子T細(xì)胞自身反應(yīng)性，否則在已產(chǎn)生自身免疫的個(gè)體中，強(qiáng)制對(duì)單個(gè)β- CAA的被動(dòng)耐受將受益甚少。

在缺乏有效刺激信號(hào)時(shí)給予靜脈注射自身抗原是誘導(dǎo)被動(dòng)耐受的經(jīng)典模式。然而，由于胸腺中將釋放新的幼稚T細(xì)胞，因而持續(xù)的抗原治療可能為維持被動(dòng)耐受所必需。此外，由于T細(xì)胞對(duì)其他β- CAAs的反應(yīng)能推動(dòng)疾病進(jìn)展，在自身免疫建立后誘導(dǎo)對(duì)單個(gè)自身抗原被動(dòng)耐受將很難奏效。因此，理論上自身免疫建立后，誘導(dǎo)長(zhǎng)期存在的調(diào)節(jié)性應(yīng)答是一種更好的治療策略。

對(duì)有1型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)患者ABTs的臨床試驗(yàn)

糖尿病預(yù)防試驗(yàn)（DPT）-1測(cè)定是否日常皮下注射胰島素和每年靜脈輸注胰島素能預(yù)防患1型糖尿病高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的疾病發(fā)生。這種治療能誘導(dǎo)β細(xì)胞休息，但因胰島素治療能增加胰島素自身抗體和誘導(dǎo)Th2應(yīng)答，其免疫學(xué)機(jī)制可能仍然被喚起。DPT-1對(duì)1型糖尿病的發(fā)生率沒(méi)有效果。由于這種治療并沒(méi)有改變主要的胰島素自身抗體(IAA)水平，其免疫學(xué)效益值得質(zhì)疑。另一方面，DPT-1發(fā)現(xiàn)口服胰島素治療并無(wú)總體效果，但能延遲高IAA亞群的1型糖尿病發(fā)病。理解此亞群中的治療收益也許能幫助設(shè)計(jì)更多有效的ABTs。導(dǎo)致缺乏總體效果的原因可能包括：未達(dá)最適劑量、免疫原降解、因給藥途徑免疫原性減弱及同時(shí)誘導(dǎo)了調(diào)節(jié)性和病理性應(yīng)答。

1型糖尿病的預(yù)測(cè)和預(yù)防研究發(fā)現(xiàn)日常鼻內(nèi)胰島素治療不能預(yù)防或延緩糖尿病的發(fā)生，即使在自身抗體上升早期就開(kāi)始治療亦無(wú)效。未發(fā)現(xiàn)任何與治療相關(guān)的β細(xì)胞反應(yīng)性抗體改變。與此相反，鼻內(nèi)胰島素試驗(yàn)顯示：對(duì)患1型糖尿病高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體應(yīng)用鼻內(nèi)胰島素，增加了抗體且降低了T細(xì)胞對(duì)胰島素的應(yīng)答，后續(xù)的臨床試驗(yàn)尚在進(jìn)行中?？傊?，這些早期的預(yù)防研究證實(shí)了其安全性，但是產(chǎn)生了關(guān)于免疫學(xué)影響、抗原遞送的最佳模式及抗原劑量的一些新問(wèn)題。

近期起病的1型糖尿病患者的ABTs干預(yù)試驗(yàn)

疾病的預(yù)防優(yōu)于在疾病發(fā)生之后的干預(yù)，但需要對(duì)有1型糖尿病危險(xiǎn)因素的個(gè)體進(jìn)行篩選，并冒著加劇疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。人們更傾向于干預(yù)試驗(yàn)，因?yàn)闈撛谑茉囌呖杀谎杆俚拇_定而且治療的有效程度可在更短的時(shí)限評(píng)估。在1型糖尿病發(fā)病后保護(hù)殘余的β細(xì)胞功能可以預(yù)防或延緩長(zhǎng)期的并發(fā)癥。

基于胰島素的干預(yù)試驗(yàn)

已有四個(gè)口服胰島素的臨床試驗(yàn)和一個(gè)在新發(fā)糖尿病患者中注射B鏈多肽被改變的胰島素(NBI-6024,皮下注射)的試驗(yàn)。大部分研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)殘余β細(xì)胞有保護(hù)效果并且對(duì)β- CAAs的自身抗體也沒(méi)有出現(xiàn)試驗(yàn)相關(guān)的改變。一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)在某小群患者中血漿C肽的水平下降得更慢。盡管如此，有2項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在口服胰島素療法的小群患者中基礎(chǔ)C肽有更快下降的趨勢(shì)，這提高了人們對(duì)此療法在某些情況下可加速疾病進(jìn)展的關(guān)注。在其他研究中，真皮內(nèi)低劑量（30μg）（非大劑量[300μg]）的可溶性DR4限制的胰島素原多肽可在1型糖尿病長(zhǎng)期患者中誘導(dǎo)短暫的白介素-10分泌型的T細(xì)胞反應(yīng)。

應(yīng)用HSPp277的干預(yù)試驗(yàn)

目前已有數(shù)個(gè)以HSPp277多肽為輔劑(Diapep)的接種疫苗的臨床試驗(yàn)，這將誘導(dǎo)IL-10(主導(dǎo)型)、IL-4和IL-13抗原特異性反應(yīng)。這些研究中大多數(shù)都報(bào)道了積極的結(jié)果。在治療前有更高的IL-10的個(gè)體對(duì)治療的反應(yīng)更好。與此研究的結(jié)果類似，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在新發(fā)的1型糖尿病患者中體內(nèi)IL-10高者更有可能經(jīng)歷蜜月期。這些研究結(jié)果提示，個(gè)體獲得調(diào)節(jié)反應(yīng)的傾向和（或）預(yù)先存在的免疫反應(yīng)可能會(huì)影響ABT誘導(dǎo)的反應(yīng)。

GAD/明礬疫苗在LADA和新發(fā)1型糖尿病中的使用

GAD/明礬疫苗的臨床試驗(yàn)首先在LADA（一種緩慢進(jìn)展的1型糖尿?。﹤€(gè)體中進(jìn)行(表1)。受試者給以安慰劑或GAD/明礬(4, 20, 100,或500 μg)皮下注射，兩次。僅當(dāng)使用500 μg劑量時(shí)提高了GAD自身抗體水平。6個(gè)月后，CD4+CD25+/CD4+CD25-細(xì)胞比例和血清C肽水平僅在20μg劑量組中較基線水平有所增加。顯然，對(duì)LADA患者ABT能產(chǎn)生有益的免疫調(diào)節(jié)作用，且體液應(yīng)答不因使用抗原而改變。5年隨訪研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的研究相關(guān)不良反應(yīng)，且僅在使用20μg劑量組中C肽水平明顯升高。若能被證實(shí)，這種治療有希望為L(zhǎng)ADA患者提供一種安全的長(zhǎng)期治療來(lái)保護(hù)β細(xì)胞功能。

20μg而非其他劑量具有顯著效果的潛在機(jī)理目前尚不明確。許多低劑量抗原通過(guò)啟動(dòng)調(diào)節(jié)性應(yīng)答常常可誘導(dǎo)耐受。高劑量抗原/佐劑通過(guò)耗竭特異性T細(xì)胞常?？烧T導(dǎo)耐受，但因某些抗原從佐劑中逸出，直接活化記憶B細(xì)胞而促進(jìn)了體液應(yīng)答，這解釋了為何高劑量GAD/明礬不僅無(wú)效且增加了GAD自身抗體。另一種解釋是，各劑量的GAD/明礬喚起了免疫應(yīng)答的不同混合（即調(diào)節(jié)性應(yīng)答，促進(jìn)病理性應(yīng)答，耗竭，無(wú)能和刪除）。20μg劑量可能誘導(dǎo)了有益/病理性應(yīng)答的最佳比例，從而產(chǎn)生了功能性耐受。與安慰劑治療對(duì)照組的PBMCs相比，經(jīng)GAD/明礬治療后1型糖尿病受試者的PBMCs可分泌更高水平對(duì)GAD有反應(yīng)的多種細(xì)胞因子，這一觀察結(jié)果支持了治療可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答混合的觀點(diǎn)(如下)。

20μg劑量GAD/明礬的有益效果經(jīng)后續(xù)針對(duì)新發(fā)糖尿病兒童的大規(guī)模臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。此項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GAD/明礬(20 μg)疫苗能保護(hù)起病6個(gè)月內(nèi)即接受治療的1型糖尿病患者的β細(xì)胞功能，但對(duì)起病6個(gè)月后才接受治療的1型糖尿病患者無(wú)效。對(duì)更早診斷的患者，治療的有效性有可能反映其殘存有更多β細(xì)胞團(tuán)。與之相似，在接受抗CD3治療時(shí)，若有很強(qiáng)的殘存β細(xì)胞功能，治療將會(huì)更有效。即使在15個(gè)月以后，治療也能誘導(dǎo)更高水平的IL-5, IL-10和 IL-13這些GAD特異性應(yīng)答以及更高頻率分泌Foxp3+和TGF-β的T細(xì)胞。有趣的是，治療亦提高了一些針對(duì)GAD的促炎細(xì)胞因子水平。這些促炎因子可能被增強(qiáng)的調(diào)節(jié)性應(yīng)答所中和或參與了調(diào)節(jié)環(huán)路。與LADA研究相對(duì)照，GAD/明礬治療顯著提高了新發(fā)1型糖尿病患者的GAD自身抗體水平，提示對(duì)GAD/明礬疫苗免疫應(yīng)答差異取決于是否個(gè)體有緩慢或更激進(jìn)的疾病進(jìn)程。進(jìn)一步分析顯示，有更高起始GAD自身抗體水平的個(gè)體對(duì)GAD/明礬有最好的應(yīng)答，這個(gè)結(jié)果來(lái)自一個(gè)關(guān)于對(duì)參與DPT-1時(shí)具有高IAA水平個(gè)體口服胰島素產(chǎn)生有利影響的觀察報(bào)告。

在此研究中，影響個(gè)體治療應(yīng)答的主要因素是治療時(shí)期，這提示治療時(shí)殘存的β細(xì)胞團(tuán)是一個(gè)影響GAD/明礬效力的主要因素。在這方面，可能比新發(fā)1型糖尿病患者擁有更多β細(xì)胞團(tuán)的LADA患者（即他們尚未有胰島素依賴），在使用20μg GAD/明礬治療1年后，其C肽分泌竟然較基線水平有增加，這一點(diǎn)值得注意。重要的是，盡管接受GAD/明礬治療的新發(fā)1型糖尿病患者，其胰島素分泌逐漸下降，其下降速度與抗CD3治療后所報(bào)道的相似，但GAD/明礬療法并無(wú)顯著的副作用。基于以上原因及GAD/明礬制品的相對(duì)穩(wěn)定性，這種治療在發(fā)展中國(guó)家很適于應(yīng)用。

ABTs的安全性

大量的動(dòng)物模型證實(shí)ABTs可致潛在的有害影響。例如，當(dāng)新生的NOD小鼠用任何β-CAA 的IFA免疫后，四周齡時(shí)即可對(duì)給予的β- CAA產(chǎn)生早熟的Th2（主要的）應(yīng)答和一些Th1應(yīng)答。因此，盡管在胰島炎和使用Th2促進(jìn)佐劑之前處理NOD小鼠，ABT促進(jìn)了針對(duì)所注射β- CAA的一些Th1應(yīng)答。顯然，部分或完全活化的Th1細(xì)胞對(duì)許多不同β- CAAs的反應(yīng)在發(fā)生胰島炎之前已存在于NOD小鼠中，在增加的自身抗原刺激下，它們將快速擴(kuò)增至可檢測(cè)水平。此外，口服胰島素加重了BB大鼠病情，胰島素B(9-23)/IFA提高了年長(zhǎng)NOD小鼠的同源Th1應(yīng)答，粘膜自身抗原遞呈可預(yù)備病理性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，重復(fù)給予β- CAA多肽可誘發(fā)過(guò)敏，Th2細(xì)胞能在免疫缺陷的小鼠中誘發(fā)疾病，誘導(dǎo)對(duì)HSPs的自身免疫可致使摧毀大鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞。最后，多數(shù)在一種名為“僵人綜合征（stiff-person's syndrome）”的罕見(jiàn)神經(jīng)紊亂疾病，有時(shí)在其他罕見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病的個(gè)體中，可發(fā)現(xiàn)GAD自身免疫性，這引起了對(duì)ABTs推動(dòng)GAD自身免疫性而致神經(jīng)系統(tǒng)毒害后果的關(guān)注。

表2 1型糖尿病使用ABTs未解決的問(wèn)題

基于迄今所得1型糖尿病的臨床試驗(yàn)，一些跡象表明，口服胰島素可加速新發(fā)1型糖尿病患者亞組C肽水平的下降，且依劑量的不同，口服胰島素可呈有益或有害作用。盡管在大多數(shù)1型糖尿病臨床試驗(yàn)中，ABT缺乏有益效果被歸因于免疫學(xué)影響不足，但其同樣也反映出ABTs同時(shí)誘導(dǎo)有益和病理性應(yīng)答而且彼此作用相互抵消。由于ABT具加速β細(xì)胞損傷的可能性，所以在糖尿病前期人群中推廣治療前，應(yīng)先檢測(cè)ABT維持新發(fā)1型糖尿病患者殘存β細(xì)胞團(tuán)的能力并評(píng)估其長(zhǎng)期安全性。

治療效能的標(biāo)記物

在NOD小鼠ABTs及人類腫瘤疫苗的研究中，發(fā)現(xiàn)抗原介導(dǎo)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度及決定簇?cái)U(kuò)展T細(xì)胞應(yīng)答至其他靶組織抗原的范圍均與較好的臨床結(jié)局相關(guān)。目前尚無(wú)可反映ABT效能的人類免疫學(xué)標(biāo)記物。急需快速評(píng)估候選治療而非依賴于長(zhǎng)期的臨床結(jié)局。盡管誘導(dǎo)抗原特異性IgG1與誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性Th2應(yīng)答在小鼠中是相關(guān)的，但是這種自身抗體同型的聯(lián)系在人類中尚不明確。此外，GAD/明礬治療LADA患者的觀察結(jié)果提示，體液應(yīng)答不一定與治療效能相關(guān)。

目前測(cè)定人類T細(xì)胞應(yīng)答的數(shù)量和功能表型需要許多勞動(dòng)密集型檢測(cè)。由于表達(dá)于血液中的自身抗原特異性T細(xì)胞頻率很低，因此，開(kāi)發(fā)能可再生的檢測(cè)在單個(gè)T細(xì)胞水平T細(xì)胞對(duì)多種β- CAAs刺激應(yīng)答的試驗(yàn)是有價(jià)值的。這些檢測(cè)以及對(duì)不同β- CAA特異性抗體亞類的檢測(cè)有希望使臨床試驗(yàn)中ABTs的效能得以評(píng)估。此外，成像技術(shù)，如核磁共振顯像和正電子成像術(shù)，增加了非侵入性顯示人類胰島炎和β細(xì)胞團(tuán)的可能性，只是價(jià)格昂貴。

未來(lái)展望

較免疫抑制療法，ABTs的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)免疫系統(tǒng)較小的損害，并相對(duì)而言在制造、試驗(yàn)和保管上更簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)。ABTs臨床試驗(yàn)的重點(diǎn)在對(duì)1型糖尿病發(fā)生后的干預(yù)。盡管如此，ABT和系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)的臨床干預(yù)試驗(yàn)都未能到達(dá)長(zhǎng)期控制正常血糖的目標(biāo)。因此，人們對(duì)聯(lián)合療法有著極大的關(guān)注，即聯(lián)用一種免疫調(diào)節(jié)劑（抗原特異性的或系統(tǒng)性免疫抑制劑）和一種促使β細(xì)胞再生的刺激劑。然而，這些療法還需反復(fù)測(cè)試，而且永久緩解很難在已經(jīng)出現(xiàn)自身免疫和β細(xì)胞數(shù)量大為減少的情況下實(shí)現(xiàn)。

長(zhǎng)期的目標(biāo)應(yīng)該著眼于預(yù)防1型糖尿病，理由如下：1）在易感性上，已有極好的基因和自身抗體的標(biāo)記物，而且1型糖尿病有很長(zhǎng)的前驅(qū)期；2）在病程的早期微創(chuàng)治療可能就起效；3）預(yù)防比胰島素療法和長(zhǎng)期并發(fā)癥的治療花費(fèi)更少。加強(qiáng)對(duì)β- CAAs的調(diào)節(jié)反應(yīng)的ABTs，似乎是對(duì)長(zhǎng)期具有高危因素人群最有希望和安全的單一療法。隨著預(yù)防性治療變得可能，發(fā)明便宜而高效地篩選那些具有1型糖尿病高危因素人群的方法變得十分重要。通過(guò)郵寄血液斑點(diǎn)收集卡做自身抗體的檢測(cè)可以提供高性價(jià)比的疾病監(jiān)控和預(yù)防。

今后可深入開(kāi)展以優(yōu)化ABTs的研究領(lǐng)域在表2中列出。ABTs在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中取得的成功產(chǎn)生謹(jǐn)慎的樂(lè)觀：新的治療有可能預(yù)防1型糖尿病并在1型糖尿病起病后幫助保護(hù)β細(xì)胞功能。