劉建君白克鎮(zhèn)

應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩查精神分裂癥血清蛋白標(biāo)志物

劉建君1白克鎮(zhèn)2

目的 應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS）篩查精神分裂癥患者血清蛋白標(biāo)志物。方法 采集的120份血清樣本(疾病組精神分裂癥患者44例，健康對(duì)照組40名，疾病對(duì)照組抑郁癥患者36例），利用SELDI-TOF-MS及固定金屬親和表面蛋白芯片(IMAC30），檢測血清蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將獲得的蛋白質(zhì)譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)校正和分析，篩選精神分裂癥差異蛋白。建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型并進(jìn)行序列分析，鑒定蛋白。結(jié)果 找到15個(gè)差異峰，其中質(zhì)荷比(m/z）為1 207和1 467兩個(gè)蛋白質(zhì)峰作為輸入節(jié)點(diǎn)建立的模型，其診斷效能最高。上述兩個(gè)肽均為錳過氧化物歧化酶的N端片段，序列分別為DSGEGDFLAEGGGVR和EGDFLAEGGGVR。與抑郁癥組及健康對(duì)照組相比，精神分裂癥患者血清錳過氧化物歧化酶蛋白顯著低表達(dá)。結(jié)論 精神分裂癥患者血清存在特異性蛋白，錳過氧化物歧化酶作為潛在的特異性蛋白標(biāo)志物，值得進(jìn)行進(jìn)一步研究。

精神分裂癥 表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 血清 蛋白標(biāo)志物

精神分裂癥是一種病因未明的疾病，多起病于青少年，常有感知、思維、行為等障礙和精神活動(dòng)的不協(xié)調(diào)，病程多遷延。其發(fā)生率高，影響將近1%的人口。自20世紀(jì)60年代，人們對(duì)精神分裂癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了一些有意義的探討，先后建立了多巴胺系統(tǒng)(DA）亢進(jìn)學(xué)說、5-羥色胺(5-HT）學(xué)說及γ-氨基丁酸(GABA）學(xué)說，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出新的治療藥物，但到目前為止尚無法完全解釋精神分裂癥的病因及發(fā)病機(jī)制，尚未找出有診斷意義的生物學(xué)標(biāo)志。近幾年來隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，精神分裂癥的病因?qū)W研究取得了一些新發(fā)現(xiàn)，本研究應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surface enhanced laser desorptionionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）篩選精神分裂癥患者血清蛋白標(biāo)志物，以尋找早期有效診斷精神分裂癥的客觀生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

病例組為2007年11月至2008年10月瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院精神科的住院患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版(CCMD-3）的精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，首次發(fā)病；②陽性和陰性綜合征量表(PANSS）總分≥60分；③年齡18～60歲；④入院前未服用過任何抗精神病藥物；⑤患者的法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并各種軀體疾病，如心、肝、腎、內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)等疾?。虎诰窕钚晕镔|(zhì)及藥物濫用。共入組44例，其中男性20例，女性24例；年齡19～48歲，平均(33± 8）歲；病程1～9個(gè)月，平均(4.5±2）個(gè)月。

疾病對(duì)照組為同期該院的抑郁癥患者，①符合CCMD-3抑郁癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，入院后未接受抗抑郁藥治療；②漢密頓抑郁量表(21項(xiàng)HAMD）總分≥20分；③年齡18～60歲；④入院前未服用過任何抗抑郁藥物；⑤患者的法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。共入組36例，其中男性17例，女性19例，年齡17～45歲，平均(32±9）歲，病程0.5～8個(gè)月，平均(3.8±1.7）個(gè)月。

健康對(duì)照組為同期到該院的健康體檢者40名，其中男性18名，女性22名，年齡21～50歲，平均(34±9）歲。

1.2 方法

1.2.1 收集標(biāo)本 清晨采集受試者空腹靜脈血2～3 mL，30 min內(nèi)置于4℃冰箱中，靜置1 h，分出血清后4℃3 000 r/min離心5 min，將分離的血清轉(zhuǎn)入Eppendof管并進(jìn)行編號(hào)，再次4℃3 000 r/min離心5 min，血清分裝每管100 μL，每次分裝不少于3管，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 制備樣品 取出凍存的血清置于冰上，融解后4℃10 000 r/min離心2 min，待用。

1.2.3 上樣及洗脫 將固定金屬親和表面蛋白芯片(IMAC30-Cu美國Ciphergen公司）裝入生物芯片處理器(Bioproeessor），每孔加50 μL 0.1 mmol/L硫酸銅緩沖液，室溫振蕩10 min，棄緩沖液，迅速加入200 μL去離子水，室溫震蕩1 min。立即甩干，每孔加人200 μL 0.1mmol/L pH 4.0的醋酸鈉，室溫震蕩5 min，甩去緩沖液迅速加入200 μL去離子水，室溫震蕩1 min。甩干后每孔加人200 μL磷酸鹽緩沖液(pH=7.2），室溫震蕩5 min，重復(fù)一次。甩去磷酸鹽緩沖液迅速加入50 μL已制備好的樣品，于4℃600 r/min振蕩30 min。拍干后用200 μL結(jié)合緩沖液室溫振蕩洗滌5 min后甩去緩沖液并拍干，重復(fù)2次。甩掉緩沖液，拍干后再加入200 μL高效液相純水(HPLC H2O），快速傾去，拍干，重復(fù)洗滌1次。取出芯片，放置于室溫環(huán)境中晾干。

1.2.4 點(diǎn)加能量吸收分子 點(diǎn)加1μL芥子酸(SPA）于晾干后的芯片點(diǎn)表面，室溫放置15 min，晾干。重復(fù)點(diǎn)加1μL，晾干后即可上機(jī)測量。

1.2.5 預(yù)實(shí)驗(yàn) 采用弱陽離子芯片(CM10）、金芯片(Au）、親水芯片(NP20）、固定金屬親和表面蛋白芯片(IMAC30-Cu）4種芯片對(duì)4例精神分裂癥患者、4例正常對(duì)照的血清進(jìn)行檢測，篩選得到蛋白質(zhì)峰多、蛋白質(zhì)分離效果好、差異最明顯的芯片用于本實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，IMAC30-Cu芯片用于本實(shí)驗(yàn)效果好，兩組間蛋白質(zhì)峰差異最明顯。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)選取1例樣本，同一天內(nèi)同一芯片上重復(fù)做兩次，質(zhì)譜峰一致。同一樣品不同天不同芯片上共重復(fù)做4次，質(zhì)譜圖相同，說明實(shí)驗(yàn)批內(nèi)和批間的重現(xiàn)性都好。

1.2.7 血清蛋白質(zhì)譜檢測 采用IMAC30-Cu芯片檢測上述精神分裂癥組、疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組的血清蛋白質(zhì)譜。利用PBSⅡ/C型蛋白質(zhì)指紋圖譜儀對(duì)結(jié)合在蛋白芯片表面的血清蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，設(shè)定優(yōu)化范圍為1 000～20 000質(zhì)荷比(m/z），最高檢測質(zhì)荷比為100 000，激光強(qiáng)度210，檢測敏感度9。儀器采用Ciphergen公司提供的all-inone蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子芯片進(jìn)行校正，確定系統(tǒng)的質(zhì)量偏差≤0.1%。采用Ciphergen Proteinehip軟件自動(dòng)采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并備份原始檢測圖譜。對(duì)獲得的血清蛋白質(zhì)譜圖，進(jìn)行降低基線和均一化等前期處理。

1.2.8 建立診斷模型 采用基于誤差反傳原理(error back-propagation algorithm）的多層前饋(MLP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)［1］，其輸入層、隱含層1、隱含層2及輸出層的節(jié)點(diǎn)分別設(shè)置為5、4、2及1。每一層運(yùn)算方式都采用正切S形傳遞函數(shù)并隨機(jī)初始化。以篩選的差異蛋白峰平均強(qiáng)度(average intensity）作為輸入節(jié)點(diǎn)，精神分裂癥患者的目標(biāo)輸出值為1，疾病對(duì)照和健康對(duì)照的目標(biāo)輸出值為0，采用反向傳播(back-propagation）算法［2］，建立并存儲(chǔ)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Biomarker Wizard 3.1軟件分析血清蛋白指紋圖譜，設(shè)定有意義的蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)頻率閾值為10%，分別設(shè)定5，2兩次信噪比(S/N）過濾。三組間比較時(shí)，對(duì)初步篩選的蛋白質(zhì)峰進(jìn)行F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白質(zhì)峰的檢測

利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS）(檢測120個(gè)樣品(精神分裂癥組、正常對(duì)照組和疾病對(duì)照組）血清蛋白指紋圖譜，通過Ciphergen ProteinChip 3.0軟件分析共獲得646個(gè)蛋白質(zhì)峰，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰15個(gè)(P＜0.01）。見表1。

2.2 建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

將具有明顯表達(dá)差異的15個(gè)蛋白質(zhì)峰作為區(qū)分精神分裂癥的侯選標(biāo)志蛋白分別組合，利用訓(xùn)練集樣本，建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型并進(jìn)行模擬訓(xùn)練。結(jié)果顯示，以m/z為1 207和1 467的2個(gè)蛋白質(zhì)峰作為輸入節(jié)點(diǎn)建立的模型，其模擬計(jì)算的網(wǎng)絡(luò)誤差最低。以質(zhì)荷比為1 467的蛋白峰的峰強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，以質(zhì)荷比為1 207的蛋白峰的峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立點(diǎn)圖，見圖1。

表1 精神分裂癥患者與對(duì)照血清具有表達(dá)差異的15個(gè)蛋白質(zhì)峰比較 ˉx±s，mm

圖1 質(zhì)荷比為1 207和1 467的蛋白峰在三組的峰強(qiáng)度分布

通過MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)質(zhì)荷比(m/z）為1 207和1 467兩個(gè)蛋白質(zhì)峰直接進(jìn)行了序列分析并經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫搜索，確定其為錳過氧化物歧化酶MnSOD的N端片段，序列分別為DSGEGDFLAEGGGVR和EGDFLAEGGGVR。

3 討論

蛋白組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，從整體水平研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與關(guān)系，解析蛋白質(zhì)功能與生命活動(dòng)規(guī)律的新興科學(xué)，蛋白組學(xué)主要依靠以下4種工具的結(jié)合進(jìn)行研究：①蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)；②質(zhì)譜技術(shù)；③蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；④將數(shù)據(jù)庫與質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比的軟件。

早期的精神分裂癥蛋白質(zhì)組學(xué)研究多采用雙向凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）。樣品多為尸腦組織或腦脊液，如Edgor等［3］采用2-DE分析精神分裂癥患者和健康對(duì)照的海馬組織，共發(fā)現(xiàn)108種差異蛋白。Jiang等［4］采用MALDI-TOF-MS技術(shù)分析精神分裂癥患者和健康對(duì)照的腦脊液，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白-Ⅳ(apo-lipoprotein-Ⅳ，apoA-4）顯著低表達(dá)。

表面增強(qiáng)激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS）是近幾年來興起的蛋白組學(xué)前沿技術(shù)，整個(gè)系統(tǒng)包括蛋白質(zhì)芯片、飛行質(zhì)譜和軟件分析三部分。其原理是：生物粗樣品被點(diǎn)樣至蛋白質(zhì)芯片后，蛋白質(zhì)通過親和作用作用于化學(xué)位點(diǎn)或生物學(xué)位點(diǎn)。洗去雜質(zhì)蛋白和污染物，加入能量吸收分子并干燥后，在真空管中用激光轟擊，使芯片表面的待分析物電離，形成質(zhì)荷比不同的離子，根據(jù)其在電場中飛行時(shí)間的不同繪制成質(zhì)譜圖，最后通過軟件處理獲得樣品中各種蛋白質(zhì)的信息如分子量、含量等，并進(jìn)行差異分析，從而尋找有意義的蛋白質(zhì)或圖譜。其優(yōu)點(diǎn)在于①可分析經(jīng)典技術(shù)無法分析的蛋白質(zhì)，包括疏水、等電點(diǎn)過高或過低的蛋白質(zhì)；②獲得的圖譜單一，重復(fù)性好，可用于定量分析；③樣品無需純化，可分析復(fù)雜的生物樣品，增加了發(fā)現(xiàn)生物學(xué)標(biāo)志的機(jī)會(huì)。④樣品需要量少，檢測速度快，適合臨床診斷及大規(guī)模篩查。Huang等［5］利用SELDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者甲狀腺調(diào)節(jié)蛋白和錳過氧化物歧化酶(MnSOD）兩種蛋白顯著低表達(dá)，該診斷模型特異性為95%，敏感性為80%。本研究結(jié)果也顯示，與抑郁癥及健康對(duì)照相比，精神分裂癥患者血清MnSOD蛋白顯著低表達(dá)。MnSOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，它能清除體內(nèi)的自由基，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞膜具有保護(hù)作用［6］，它的低表達(dá)可導(dǎo)致精神分裂癥患者神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明利用SELDI-TOF-MS檢測精神分裂癥患者、抑郁癥和健康人血清蛋白指紋圖譜，通過統(tǒng)計(jì)分析以篩選精神分裂癥患者血清可能存在的特異蛋白，是可行的。研究結(jié)果表明精神分裂癥患者和健康人血清蛋白質(zhì)譜的表達(dá)具有顯著的差異性。本研究也存在一定的局限性，如未對(duì)診斷模型的敏感性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證，樣本量偏小，樣本來源單一，未對(duì)腦脊液樣品進(jìn)行比對(duì)研究，患者病程、疾病嚴(yán)重程度、臨床分型等對(duì)蛋白標(biāo)志物是否有影響不明。這有待于大樣本多中心對(duì)照研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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3 Edgar PF，Douglas JE，Matsushma E，et al.Comparative proteome analysis of the hippocampus implicates chromosome 6q in schizophrenia.Mol Psychiat，2000，5(1）：85-90.

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Objective：This study aims to screen biomarkers in the serum from patients with schizophrenia using surface-enhanced laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry(SELDITOF-MS）.Methods：One hundred and twenty serum samples including 44 patients with schizophrenia，40 healthy controls and 36 patients with depressive disorder were collected.The serum protein spectra were detected using SELDI-TOF-MS and IMAC30(immobilized metal affinity capture）protein.Ciphergen ProteinChip 3.0 and Ciphergen Biomaker Wizard 3.1 software were used for data analysis and identification of different protein expression in schizophrenia，respectively.Results：Fifteen different peaks were found by Fast Classification Algorithm(QC）.Two highest protein peaks with mass-to-charge-ratio(m/z）1 207 and 1 467 weremangansesuperoxidedismutasefragment，whosesequenceswereDSGEGDFLAEGGGVRand EGDFLAEGGGVR.Conclusion：Manganse superoxide dismutase is a potential specific biomarker for schizophrenia.

Schizophrenia SELDI-TOF-MS Serum Protein biomarker

2009-12-22）

(本文編輯：張紅霞）

Application of SELDI-TOF-MS technology in screening of serum proteins biomarker in patients with schizophrenia Liu Jianjun1，Bai Kezhen2.1.The Third People's Hospital of Huzhou City，Huzhou 313000；2.Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000

國家“863計(jì)劃”支撐項(xiàng)目(2006AA02090407）

1.浙江省湖州市第三人民醫(yī)院 313000；2.四川瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 646000。通信作者：白克鎮(zhèn)，電子信箱baikezhen61@ 163.com