孟繁星，徐田軍，王日昕

（浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院,海洋生物資源與分子工程實驗室,浙江舟山 316004）

日本囊對蝦Marsupenaeus japonicus屬甲殼綱、十足目、游泳亞目、對蝦科、囊對蝦屬，從紅海、非洲東部到朝鮮、日本一帶沿海都有分布，在我國東南沿海也有分布[1]。自20世紀(jì)90年代我國北方養(yǎng)殖的中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis發(fā)生白斑綜合癥病毒（WSSV）病后，日本囊對蝦因肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，耐低溫、耐干能力強，逐漸成為我國的主要養(yǎng)殖品種[2]。日本囊對蝦已成為黃渤海沿岸的重點養(yǎng)殖對象,并成功地開展了大規(guī)模的人工增殖放流，獲得較高的回捕率[3，4]。許多研究表明遺傳變異水平與生物的生長速度、抗病能力等生產(chǎn)性狀密切相關(guān)[5]，隨著日本囊對蝦養(yǎng)殖面積的擴大和養(yǎng)殖苗種的推廣，其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)必定會受到影響。因此，對我國現(xiàn)有的各養(yǎng)殖場的日本囊對蝦進行科學(xué)的遺傳評估，分析其遺傳背景，從而選出優(yōu)良的品種對促進我國淡水養(yǎng)蝦業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

動物線粒體DNA（mtDNA）由于具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、母性遺傳、進化速度快等特征而被作為一種優(yōu)良的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于動物的群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)進化研究中[6]。動物線粒體基因組中含細胞色素氧化酶（cytochrome c oxidase）三個亞基基因(COI,COII,COⅢ)、Cytb、ATPase6、ATPase8等 13個結(jié)構(gòu)蛋白基因，它們都是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的重要組分,是研究遠緣物種分子系統(tǒng)演化和分類的有效基因[7]。本研究以浙江、福建、臺灣的日本囊對蝦為研究對象，對其線粒體COⅢ基因進行了分析，旨為進一步研究日本囊對蝦分子系統(tǒng)學(xué)及其種群遺傳學(xué)和自然種質(zhì)資源保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的日本囊對蝦3個群體的樣本分別采于我國東南沿海的浙江(ZJ)、福建（FJ）、臺灣（TW）沿海，新鮮樣品低溫冷凍后長期保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組 DNA 的提取

采取常規(guī)苯酚氯仿提取法，并略有改進，每個樣本取100 mg左右的尾部肌肉，剪碎后，加入500 μL組織勻漿緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;100 mmol/L EDTA，pH 8.0)，混勻后加入終濃度為 1%的SDS和100 μg/mL的蛋白酶K，55℃消化3 h,然后分別用等體積的 Tris飽和酚、Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提1次。無水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌2次，TE溶解。 紫外分光光度計測定樣品DNA溶液的濃度和純度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴增和產(chǎn)物鑒定

用于PCR擴增的引物分別為4750F:GACACCACGCCTTCCACCTA和5523R:GCAGCAGCTTCAAATCCAAA，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)在Bio-Rad Mycycler型PCR儀上進行。反應(yīng)體系為 50 μl，其中含 10×Buffer 5 μL，dNTP 各 0.2 mmol/L ，上、下游引物各 0.2 μmol/L,模板 DNA 50～100 ng，Taq plus DNA聚合酶2 U(Tiangen)，MgCl21.5 mmol/L。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。每次反應(yīng)都設(shè)不含模板的空白對照。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為0.5×TBE(pH 8.0)，電壓為5 V/cm，常溫電泳，EB染色，用Bio-Rad GD2000型凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.3 DNA 序列測定

將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)有限公司，純化后直接進行測序反應(yīng)，測序引物為4750F:GACACCACGCCTTCCACCTA。

1.2.4 序列分析

獲得的序列經(jīng)人工校正后在NCBI中進行同源序列BLAST，確認其為日本囊對蝦COⅢ基因的部分DNA序列，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了加州美對蝦（Farfantepenaeus californiensis，EU497054）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon，AF217843）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei，NC_009626）、細角濱對蝦（Litopenaeus stylirostris，EU517503）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis，DQ518969）等 5 種對蝦的 COⅢ 基因的DNA序列用于系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析。利用MEGA4.0軟件分析DNA序列，計算堿基組成比例和遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用DnaSP4.0軟件進行多態(tài)性指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 日本囊對蝦COⅢ序列特征及突變分析

對所有測得的日本囊對蝦3群體的COⅢ序列進行比對后，共得到了577 bp用于進行分析的基因序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列對比后發(fā)現(xiàn)與對蝦科的其他蝦類具有很高的相似性，適合進行分析。堿基組成見表1，T、C、A、G四種堿基的含量分別為27.2%、16.5%、33.8%、22.6%，在所有試驗個體中沒有明顯差異，A+T平均含量為61%，明顯高于G+C的39%。在所測序列中共有51個變異位點，占位點總數(shù)的8.8%，共有簡約信息位點18個，占位點總數(shù)的3.1%，無插入或缺失位點，轉(zhuǎn)換與顛換比值為4.6；臺灣群體中包含變異位點11個，簡約信息位點7個，浙江群體中包含變異位點25個，簡約信息位點5個，福建群體中包含變異位點29個，簡約信息位點3個。這3個群體的平均核苷酸變異數(shù)為4.537。

表1 5種對蝦mt DNA COⅢ基因部分序列的堿基組成Tab.1 Base composition in partial mtDNA COⅢgene sequences of five species of penaeidae

從51個COⅢ堿基序列變異位點中，共定義了31個單倍型，用H1～H31表示，單倍型及其位點見表2。臺灣、福建、浙江群體中分別有9、13、11個單倍型。日本囊對蝦3個群體的遺傳多樣性參數(shù)見表3，福建群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最高，分別為0.989和0.009 2；而臺灣群體則最低，分別為0.964和0.005 8，浙江群體居中，分別為0.989和0.007 8。

表2 日本囊對蝦COⅢ序列核苷酸多態(tài)位點及其各單倍型Tab.2 Nucleotide polymorphic sites and haplotypes in COⅢgene sequences of M.japonicus

表3 日本囊對蝦3個群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Parameters summary of genetic diversity of M.japonicus from the three stocks

2.2 日本囊對蝦的遺傳多樣性分析

基于所測得的3種日本囊對蝦和對蝦科中另外5種對蝦的COⅢ同源序列，采用Neighbor-Joining法[8]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，用Kimura雙參數(shù)法（Kimura 2-parameter）計算遺傳距離，用MEGA4.0軟件[9]進行系統(tǒng)發(fā)生的分析。發(fā)現(xiàn)日本囊對蝦的三個群體先聚成一小枝，再與中國明對蝦聚成一大枝；凡納濱對蝦和細角濱對蝦聚成一小枝，再分別于加州美對蝦和斑節(jié)對蝦聚成另一大枝。

圖1 NJ法構(gòu)建的6種對蝦的分子系統(tǒng)樹Fig.1 Molecular phylogenetic tree of six species of penaeidae shrimp

3 討論

ZARDOYA等[10]分析了脊椎動物mtDNA基因上13個蛋白編碼基因包含的系統(tǒng)發(fā)育信息，不考慮數(shù)據(jù)處理和加權(quán)的方法，將13個基因分為好、中、差3組。好的一組基因含有良好的系統(tǒng)發(fā)育信息，它們是：ND4、ND5、ND2、Cytb 和 CO I；中等的一組基因含有一定的系統(tǒng)發(fā)育信息，它們是：COII、COⅢ 、ND1 和ND6；差的一組基因不能很好地提供系統(tǒng)發(fā)育信息，它們是：ATPase6、ND3、ATPase8和ND4L。而日本學(xué)者MIYA等[11]對已知分類關(guān)系的8種硬骨魚類的線粒體不同蛋白質(zhì)編碼基因所含有的系統(tǒng)發(fā)育信息進行了研究后表明，13個蛋白編碼基因含有的系統(tǒng)發(fā)育信息明顯不同，大致分為非常好、好、中等、差和非常差5個類別。 非常好的一組包括ND5、ND4、COⅢ 和COI，好的一組包括COII和Cytb，中等的一組包括ND3和 ND2，差的一組包括ND1和ATPase 6，非常差的一組包括ND4L、ND6和 ATPase 8。這與ZARDOYA的觀點有所差異，MIYA認為觀察的普遍性還不能確認，需要進一步研究。一些研究學(xué)者認為，對屬內(nèi)不同種、種內(nèi)不同亞種或不同地理型之間的物種鑒定，COⅢ基因不失為一種較為有效的分子標(biāo)記[12-14]。

本研究測得了日本囊對蝦COⅢ基因的部分堿基序列，其中AT含量為61%，明顯高于GC含量，這和在其他甲殼類中觀察到的mtDNA的堿基分布情況相似[15-18]。序列的堿基組成也符合AT含量高，堿基G的相對缺乏是動物mtDNA堿基組成的特點。在線粒體中，變異位點的轉(zhuǎn)換較易在近親種間頻繁地發(fā)生，而顛換在較遠緣種間逐漸明顯；在同一物種中，轉(zhuǎn)換往往在數(shù)量上遠超過顛換[19]。本研究中日本囊對蝦mtDNA COⅢ堿基序列轉(zhuǎn)換與顛換比為4.6，這與核苷酸的替換主要以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換多于顛換，表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)換偏向[20]的規(guī)律相符。這也說明本文所研究的3個日本囊對蝦群體線粒體的變異仍然是種內(nèi)變異。

用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示日本囊對蝦的3個群體先聚成一小枝，再與中國明對蝦聚成一大枝；凡納濱對蝦和細角濱對蝦聚成一小枝，再分別于加州美對蝦和斑節(jié)對蝦聚成另一大枝。目前對于對蝦科種類的mtDNA COⅢ基因的研究較少，本次實驗得到了日本囊對蝦mtDNA COⅢ基因序列，雖然發(fā)現(xiàn)這3個群體間存在一定的差異，但是由于變異位點較少，不足以準(zhǔn)確地區(qū)分日本囊對蝦這3個群體的遺傳特性。本研究接下來會對線粒體其他變異較大的基因(如COI、Cytb、D-loop)進一步分析，以得到更多的信息，從而更全面、更客觀地了解日本囊對蝦的遺傳背景。

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