曾海波,曾榮今,姚 飛

(湖南科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湘潭411201)

枸骨(Llex cornutaLindl)為冬青科的常綠灌木或小喬木,分布浙江、江西、湖南、廣西等地.近年來對枸骨葉成分的研究發(fā)現(xiàn),其富含多種具有廣泛生物活性的黃酮類化合物,如蘆丁、楊梅甙、槲皮素、山奈酚、金絲桃甙、異鼠李素等[1-3]這類物質(zhì)大多有抗菌、消炎和擴(kuò)張血管等作用[4].目前對枸骨根成分的研究還很少,本文初步探索了從枸骨根中提取分離黃酮類物質(zhì),并首次從枸骨根中提取分離得到了黃酮類化合物--槲皮素.

1 材料與儀器

1.1 材料

(1)原料

枸骨根系課題組采自湖南隆回縣,由湖南科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院曾榮今教授鑒定.

(2)試劑

甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、醋酸均為分析純,由湖南師范大學(xué)試劑廠提供.硅膠:100～200目,200～300目柱層析用硅膠,青島海洋化工廠.

1.2 儀器

HPLC:Waters Delta高效液相色譜儀(包括600泵、996 PAD檢測器,Millennium32數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)),色譜柱:Waters C18 Column;

LG-500粉碎機(jī),轉(zhuǎn)速2500 r/min;

SB320型超聲波震蕩儀(Shanghai Branson);

Sigma 3K15離心機(jī),最大轉(zhuǎn)速:15300 rpm,最小轉(zhuǎn)速:100 rpm;

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司);

SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);

2 提取分離純化工藝

將洗凈的枸骨根在70℃恒溫干燥、粉碎,稱取4 kg枸骨根用粉碎機(jī)粉碎成100目粉末,按照液料比(V/W)12∶1,用70%乙醇浸泡枸骨粉末3 h后,再用超聲震蕩提取30 min,得到的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮,回收溶劑.再用回收的溶劑重新浸泡濾渣,多次重復(fù)提取,直到提取液顏色為很淡的黃色;合并濃縮物,再減壓濃縮至有少量黑色浸膏的棕黃色液體,過濾.濾渣用熱水浸提,過濾,洗液和濾液合并,經(jīng)減壓蒸餾后,再用乙酸乙酯萃取,得乙酸乙酯提取物.所得乙酸乙酯提取物經(jīng)減壓蒸餾、無水硫酸鈉干燥得到提取物固體.將提取物固體粉碎,加適量乙醇溶解、精制,用硅膠柱(140～160目)進(jìn)行柱層析分離;依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇洗脫,收集氯仿洗脫液;將收集到的氯仿洗脫液濃縮,再硅膠柱(140～160目)進(jìn)行柱層析分離,依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇洗脫.收集氯仿洗脫液,濃縮至干,甲醇溶解備用(淺黃色溶液).具體工藝流程如下圖所示:

3 鑒定與分析

3.1 定性分析

三氯化鋁反應(yīng):往樣品的甲醇溶液中(淡黃色)加入1%的三氯化鋁溶液,呈鮮黃色.紫外光下觀察為黃綠色熒光.因為在含有黃酮類化合物的溶液中加入某種金屬離子(如 Al3+、Zn2+、Til3+等),這時母核中某些位置上的H(3、5位上)為羥基所取代,能夠與金屬離子形成絡(luò)合物,而黃酮類化合物與金屬離子形成的絡(luò)合物一般為黃色或橙色[5].據(jù)此推測所得的物質(zhì)為黃酮類化合物.

3.2 紅外光譜解析

各個峰的歸屬如下:1611.1 cm-1、1561.26 cm-1、1522.12 cm-1、1461.90 cm-1、 1450.19 cm-1:苯環(huán)的骨架振動,證明苯環(huán)的存在;3407 cm-1、3200 cm-1:強(qiáng)、寬的締合,證明有 O-H;1665.05 cm-1:羰基吸收峰[6].

3.3 質(zhì)譜圖解析

碎片峰有[M-H]-m/z301,[M+H]+m/z303,m/z285,m/z274,m/z153,m/z137;因為[MH]-m/z 301,[M+H]+m/z303所以分子離子M+m/z302.黃酮類化合物質(zhì)譜圖中分子離子峰應(yīng)為偶數(shù),通常是以主峰的形式出現(xiàn);而且必須是一個合理的分子量[7].如黃酮、異黃酮類化合物以222為基數(shù);黃烷酮和查爾酮類化合物為324;黃酮醇類化合物為238;雙氫黃酮類化合物為240等.每加一個-OH就要增加16個質(zhì)量單位,以此類推.而化合物的分子離子M+在m/z302.可以判斷是黃酮醇類化合物增加了4個-OH.對質(zhì)量數(shù)m/z303做二級質(zhì)譜分別得到[M-18]+m/z285;[M-29]+m/z274(特征分裂);m/z153;m/z137.[8]質(zhì)譜碎裂機(jī)制及各個峰的歸屬如下圖所示:

3.4 核磁共振譜圖

3.4.11H-NMR譜圖解析

3.4.213C-NMR譜圖解析

(13CNMR):δ175.68(C4),δ164.15(C2),δ161.39(C8a),δ156.85(C7),δ147.48(C5),δ146.08(C4′),δ144.97(C3′),δ135.88(C1′),δ122.85(C6′),δ120.57(C5′),δ115.31(C2′),δ114.48(C4a),δ103.22(C3),δ98.27(C8),δ93.57(C6).化合物的13C-NMR譜圖給出的15個碳信號,是典型的C6-C3-C6的黃酮骨架結(jié)構(gòu);在δ175.68出現(xiàn)了黃酮醇C4的羰基(C=O)的典型峰信號[6].

4 結(jié) 論

根據(jù)以上結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分析,本文獲得的化合物光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9-12]報道的槲皮素相關(guān)數(shù)據(jù)一致,基本可以確定該化合物為3,5,7,3＇,4＇-五羥基黃酮,又叫槲皮素(結(jié)構(gòu)如下).

(分子式:C15 H 10O7)

雖然黃酮類化合物存在于許多高等植物中,但本文是首次從構(gòu)骨根中提取到黃酮類化合物——槲皮素,對于深入研究構(gòu)骨根的化學(xué)活性成份有重要意義.有關(guān)構(gòu)骨根中其它成分的分離、結(jié)構(gòu)鑒定有待我們進(jìn)一步深入地開展工作.

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