李 炫，彭克勤，劉正初

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410006）

甘露聚糖酶是一種重要的工程酶，能降解甘露聚糖、木質(zhì)素等物質(zhì)，在紡織、造紙、飼料、食品、石油開采等諸多領(lǐng)域都有重要用途[1]。該酶在對草本植物纖維提取中半纖維素的降解方面起著舉足輕重的作用[2]。中國農(nóng)科院麻類研究所工程酶實(shí)驗(yàn)室篩選到的歐文氏菌CXJZ95-198具有較高的甘露聚糖酶活性，張運(yùn)雄等克隆到其甘露聚糖基因manA，分析發(fā)現(xiàn)manA基因的DNA序列與其他DNA序列同源性很低[3-4]。本研究構(gòu)建了N端缺失片段的表達(dá)載體，初步研究了manA N端部分序列的功能，旨在為以后改造甘露聚糖酶基因提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 歐文氏桿菌CXJZ95-198，大腸桿菌E.coliBL21（DE3），載體pET 28 a由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所工程酶實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑BamHI、HindIII、T4連接 酶 、PCR Supermix、DNA mark III 等 均 購 自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及目的基因的PCR擴(kuò)增 如表1所示，根據(jù)GenBank報(bào)道的甘露聚糖酶基因序列（DQ364440）設(shè)計(jì)了以下5個(gè)引物，均由上海生工合成。用PCR方法對CXJZ95-198全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min，94℃，變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 60 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸 10 min，冷卻至4℃。

1.2.2 manA及缺失片段突變體的獲得 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、膠回收后，分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3 h，回收目的片段，連入pET 28 a載體。連接過夜體系如下：1 μL pET 28 a載體，5 μL 目的 DNA，1 μL T4 DNA 連接酶，3 μL dd H2O。連接產(chǎn)物通過42℃熱激轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞里，37℃ 恢復(fù)培養(yǎng)1 h后涂于含50 μg/mL卡那霉素的選擇性LB平板上，倒置37℃培養(yǎng)過夜。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.3 表達(dá)載體的鑒定 用BamHI和HindIII對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)3 h，電泳檢測酶切。

1.2.4 表達(dá)載體在大腸桿菌里的表達(dá)與甘露聚糖酶活性的鑒定 挑取陽性克隆子接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)5 h，點(diǎn)種于甘露聚糖酶篩選平板上，37℃培養(yǎng)過夜，觀察透明圈產(chǎn)生情況。

1.2.5 重組子表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析 對重組子表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺失表達(dá)載體的構(gòu)建

質(zhì)粒在酶切以前是閉環(huán)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，無法被凝膠電泳反映其真實(shí)大小，但被限制性內(nèi)切酶切成線性形狀后，它的長度可以在電泳圖中反映出來，圖1是pET 28 a在BamHI和HindIII雙酶切后的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，條帶大小約是5 000 bp左右，與pET 28 a質(zhì)粒的實(shí)際大小5 361 bp相符。

以CXJZ95-198基因組為模板，如表2所示，按目的片段 pF1（F1/R1）、pF2（F2/R1）、pF3（F3/R1）、pF4（F4/R1）加入相應(yīng)的正反引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2），結(jié)果表明目的片段擴(kuò)增特異性很好，濃度合適。

表2 擴(kuò)增缺失片段的對應(yīng)引物以及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

2.2 缺失表達(dá)載體的質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

分別提取能在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板中生長的pF1-pF4轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，5 μL質(zhì)粒加入BamHI和HindIII 37℃保溫2 h后用凝膠電泳驗(yàn)證。如圖3所示，1～4泳道中4 500 bp以上的條帶是大小為5 000 bp左右的pET 28 a質(zhì)粒，1 200～800 bp之間呈梯度排列的條帶是pF1-pF4 DNA片段，說明所挑取的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。

2.3 重組子的甘露聚糖酶活性活性鑒定

挑取pF1-pF4轉(zhuǎn)化子的典型菌落點(diǎn)在甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，觀察各轉(zhuǎn)化子在甘露聚糖篩選培養(yǎng)基上所表現(xiàn)的透明圈可初步判斷該轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶情況。如圖4所示，陽性對照歐文氏桿菌CXJZ95-198產(chǎn)酶能力很高，生成的水解圈比其他各缺失表達(dá)體系都大，說明該酶在大腸桿菌高效表達(dá)體系中優(yōu)勢不明顯。陰性對照大腸桿菌E.coliBL21（DE）不分泌甘露聚糖酶，不產(chǎn)生透明圈。4個(gè)缺失表達(dá)體系橫向?qū)Ρ?，pF1透明圈最大，pF2和pF3酶活性較pF1大幅下降，pF4沒有甘露聚糖酶活性，pF1和pF2橫向?qū)Ρ日f明缺失了的信號肽序列對酶活或者酶的分泌能力有負(fù)面影響，pF2和pF3透明圈大小無明顯差異說明N端信號肽后10個(gè)AA對該酶的活性無影響，可刪除。pF4和pF3比較說明pF4多刪除的10個(gè)AA對該酶的活性有非常重要的影響。

2.4 重組子表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

分別挑取pF1-pF4四種菌的陽性克隆子的單菌落，在5 mL含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)6 h，再將活化菌按2%的比例接種100 mL含有同樣濃度的卡那霉素LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，OD600=0.6時(shí)加入0.8 mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，20 h后分別收集菌體跑SDS-PAGE電泳。

如圖5所示，在45 kD左右能很清晰地看到很明顯的蛋白條帶，比其他條帶濃很多，大小與預(yù)測的大小相符，可以認(rèn)為是目的蛋白帶，pF1-pF4的蛋白帶由大到小成成的梯度反應(yīng)了依次缺失的序列所翻譯的蛋白質(zhì)大小依次縮小。與目的期望相符，pF1強(qiáng)表達(dá)兩條帶，大小相差不多，除了預(yù)測在45 kD以上的那條帶以外在小于45 kD的地方也強(qiáng)表達(dá)一條帶，從氨基酸序列信號肽預(yù)測得知manA N端前27個(gè)AA為信號肽序列，pF1包含了信號肽序列，pF2-pF4都缺失了信號肽序列，所以pF1的胞內(nèi)蛋白存在分泌途徑已切除信號肽和未切除信號肽，有兩條帶，其他重組子胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物只有一條帶。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了4種不同的表達(dá)載體，分別是pF1（manA全長），pF2（N端27個(gè)AA缺失），pF3（N端37個(gè)AA缺失），pF4（N端47個(gè)AA缺失）。用甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基檢測發(fā)現(xiàn)，pF4不表現(xiàn)出甘露聚糖酶活性，pF3，pF2都表現(xiàn)出較弱酶活性，pF1酶活性最高，但也低于原始菌CXJZ95-198，表明ManA N端37-47個(gè)AA可能對該酶結(jié)構(gòu)或活性有重要影響。N端27-37個(gè)AA缺失對該酶無明顯影響，N端信號肽缺失對該酶的分泌有較大負(fù)面影響。在對蛋白SDS-PAGE膠進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)pF1表達(dá)兩條帶，大小相差不多，除了預(yù)測在45 kD以上的那條帶以外在小于45 kD的地方也強(qiáng)表達(dá)一條帶，胞外分泌蛋白重量最大的pF1卻比pF2，pF3，pF4的蛋白條帶小，甚至小于45 kD。推測因?yàn)閜F1包含了信號肽序列，pF2－pF 4都缺失了信號肽序列，所以pF1的胞內(nèi)蛋白存在分泌途徑已切除信號肽和未切除信號肽，有兩條帶。胞外分泌蛋白只表示切除信號肽分泌到胞外的，所以只有一條帶。

[1]吳 襟.微生物 β-甘露聚糖酶 [J].微生物通報(bào)，1999，26（2）:134-136.

[2]劉正初.麻類纖維提取工程微生物研究回顧與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（增刊）：1363-367.

[3]yunxiong Z，zhengchu L，Xinbo C.Cloning and expression of a mannanase gene from Erwinia carotovora CXJZ95-198[J].Annals of microbiology，2007，57（4）：623-628.

[4]張運(yùn)雄.麻類生物脫膠與生物制漿酶系[J].中國麻作，2003，24（2）：14-17.

[5]張龍翔，張廷方，李令媛.生化試驗(yàn)方法與技術(shù) [M].北京:高等教育出版社，1997.