林文力，牟海青，廖曉蘭

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所，北京 100029）

植原體（Phytoplasma），原稱類(lèi)菌原體（Mycoplasma-like orpanism，簡(jiǎn)稱MLO）是一類(lèi)無(wú)細(xì)胞壁、存在于植物篩管內(nèi)的專性寄生細(xì)菌，主要依靠葉蟬和飛虱等從韌皮部取食的昆蟲(chóng)傳播，也可由菟絲子和人工嫁接傳病，常引起植物從枝、黃化、花變?nèi)~、頂枯等癥狀[1]。綜合世界各地的報(bào)道，植原體可引起多達(dá)1 000余種植物的系統(tǒng)性病害，涵蓋各類(lèi)農(nóng)作物、園藝、花卉、果樹(shù)和林木等病害。其中，我國(guó)報(bào)道的有100多種，給經(jīng)濟(jì)作物造成了巨大損失[2]。由于植原體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，故對(duì)其生物學(xué)特性研究較少。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，核酸雜交、血清學(xué)和PCR等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，極大改善了研究者對(duì)植原體鑒定和分類(lèi)的手段[3]。根據(jù)植原體通用引物和特異性引物可以特異地?cái)U(kuò)增出16S rDNA基因序列，這是植原體分類(lèi)的重要參考依據(jù),也是被國(guó)際上普遍接受的植原體鑒定分類(lèi)方法[4]。

棗樹(shù)在我國(guó)廣泛栽培，遍布全國(guó)各地，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。棗瘋病（Jujube witches′-broom，JWB）是由植原體引起的一類(lèi)病害，棗樹(shù)一旦患病,通常在2～3 a內(nèi)喪失產(chǎn)量并很快導(dǎo)致植株死亡。1981年，王祈楷等通過(guò)系統(tǒng)比較，確定了棗瘋病是由植原體侵染所引起的，而不是病毒類(lèi)或者病毒與植原體的復(fù)合侵染所致。棗瘋病發(fā)病過(guò)程從外觀上看可分為以下幾個(gè)階段：健康葉片→花葉→變態(tài)花蕾→花變?nèi)~→叢枝[5]。

本研究對(duì)我國(guó)北京地區(qū)棗瘋病植原體16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，并與已知的植原體序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，明確北京地區(qū)棗瘋病的分類(lèi)地位，以期為棗瘋病植原體的遺傳變異、致病機(jī)理等研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病棗樹(shù)樣品采自北京昌平區(qū)西峰山村小棗林?？寺≥d體PMD18-T、限制性內(nèi)切酶及其它酶類(lèi)等分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖匈?gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

1.2 植物總DNA提取

照顧沛雯等[6]的方法提取植物樣品的總DNA，于-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定

利用Gundersen等[7]設(shè)計(jì)的通用引物,通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增植原體16S rDNA。PCR以植株總DNA為模板,以 R16F2n（5′-GAAACGACTGCTAAGACTG G-3′）和 R16R2（5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAA CCCCG-3′）引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)處理 5 min；94℃ 40s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，共 35 個(gè)循環(huán)；最后72℃10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增出的目標(biāo)產(chǎn)物純化回收，克隆入PMD18-T載體中，通過(guò)PCR篩選陽(yáng)性克隆，序列測(cè)定委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.4 序列分析及同源性比較

利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），通過(guò) DNAMAN5.2.2及 MEGA4.1軟件進(jìn)行同源性比較及系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

棗瘋病感病植株總DNA經(jīng)直接PCR及巢式PCR擴(kuò)增后,得到大小約1.2 kb的特異片段，片段大小與引物設(shè)計(jì)的相符，而健康植株和雙蒸水對(duì)照均未出現(xiàn)特異擴(kuò)增帶（圖1）。將此植原體命名為棗瘋病西峰山棗株系（JWB-XFSZ）。

2.2 植原體16S rDNA片段的序列分析

將16S rDNA目的片段克隆后測(cè)序，結(jié)果表明北京昌平區(qū)西峰山村小棗（JWB-XFSZ）的16S rDNA擴(kuò)增片段含有1248個(gè)核苷酸（表1），G+C的含量為45.7%。利用GenBank中的BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索，北京昌平地區(qū)棗瘋病與16SrⅤ組各植原體的16S rDNA基因序列同源性達(dá)98.5%以上，其中與16S rⅤ組的榆樹(shù)黃化有98.96%、與懸鉤子叢枝病有98.64%的同源性。JWB-XFSZ與16SrV-C亞組的棗瘋病韓國(guó)株系（登錄號(hào)AB052879）同源性最高，達(dá)99.51%，而與其它16Sr其它各組的同源性均在95%以下，表明JWB-XFSZ和棗瘋病韓國(guó)株系一樣應(yīng)歸屬于16SrV-C亞組。

表1 JWB-XFSZ 16S rDNA基因的測(cè)序結(jié)果

2.3 棗瘋病植原體系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建與分析

將已登陸Genebank的部分植原體16S rDNA基因序列下載下來(lái)，與JWB-XFSZ所測(cè)定的16S rDNA序列進(jìn)一步進(jìn)行同源性分析，利用MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，JWB-XFSZ與JWB不同地區(qū)的株系；與Elm yellows、Honeylocust yellows、Cherry lethal yellows、Hemp fiber witches-broom、Peach yellows以及 Paper mulberry witches-broom等16SrⅤ組的植原體在同一個(gè)進(jìn)化枝上，說(shuō)明JWB-XFSZ與16SrⅤ組的親緣關(guān)系最近。

圖2 構(gòu)建28種植原體株系16S rDNA基因核苷酸序列同源關(guān)系進(jìn)化樹(shù)

3 討 論

16S rDNA是原核生物染色體基因組中的一種rDNA編碼區(qū)序列，在進(jìn)化中高度保守，常作為原核生物系統(tǒng)發(fā)育及分類(lèi)研究的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究運(yùn)用分子生物學(xué)的方法對(duì)北京西峰山小棗棗瘋病植原體的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、序列測(cè)定及同源關(guān)系分析,確定了該植原體株系的分類(lèi)地位。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)棗瘋病植原體病原做了大量研究，以期為棗瘋病的防治提供參考依據(jù)。Seemüller等[8]認(rèn)為植原體病害雖發(fā)生在世界各地，但不同組及亞組的植原體在分布上存在明顯的地區(qū)差異，如16S rV-A主要發(fā)生在北美國(guó)家，16S rV-C主要發(fā)生在歐洲，而16S rV-B主要發(fā)生在亞洲。從本研究擴(kuò)增到的棗瘋病植原體16S rDNA基因來(lái)看，JWB-XFSZ 株系與 JWB-henan、JWB-Zahuangdazao、JWB-xiangshan、JWB-Junzao 以 及JWB-Kor各株系均只有幾個(gè)堿基的差異，說(shuō)明棗瘋病植原體暫時(shí)還未存在株系上的變化。JWB-XFSZ株系與JWB-Kor韓國(guó)株系的差異最近，說(shuō)明北京西峰山棗瘋病植原體與韓國(guó)報(bào)道的植原體是同一種病害。在本研究過(guò)程中在病株樣品中未擴(kuò)增到其他植原體，說(shuō)明未存在復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

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