陳陽(yáng)婷 ，寧 紅 ，張 敏

（1.成都農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所，四川 成都 610072；2.四川省植物檢疫站，四川 成都 610041；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 雅安 625014）

快速診斷馬鈴薯病毒病是種薯品質(zhì)鑒定的重要內(nèi)容。在我國(guó)，主要的馬鈴薯病毒種類(lèi)有馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX），馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY），馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV），馬鈴薯 A 病毒（Potato virus A，PVA）及馬鈴薯S病毒（Potato virus S，PVS）。對(duì)生產(chǎn)影響最大的病毒是PVY和PLRV，其次是PVX和PVA，PVS影響較小[1]。通過(guò)3 a田間調(diào)查及分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在四川地區(qū)，PVX、PVS、PVA及PLRV往往復(fù)合侵染，迫切需要經(jīng)濟(jì)方便的多重檢測(cè)方法。本研究設(shè)計(jì)了這4種病毒的引物，從退火溫度、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中dNTPs濃度、PCR反應(yīng)中Mg2+濃度、循環(huán)條件4方面優(yōu)化反應(yīng)條件。優(yōu)化后的三重RT-PCR反應(yīng)體系，可以同時(shí)檢測(cè)田間復(fù)合侵染的3種馬鈴薯病毒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從田間采集感染有馬鈴薯病毒的發(fā)病植株，以ELISA方法確定病毒種類(lèi)，分別將PVX、PVS、PLRV和PVA混合接種于防蟲(chóng)溫室內(nèi)種植的健康馬鈴薯植株上，以植物組織培養(yǎng)室內(nèi)經(jīng)過(guò)莖尖脫毒的馬鈴薯組培苗作為陰性對(duì)照。

1.2 病毒RNA的提取

采用北京TIANGEN生化科技有限公司的RNAprep Plant Kit試劑盒提取帶毒馬鈴薯植株的總RNA作為待測(cè)的病毒RNA。

1.3 cDNA的合成

根據(jù) PVX、PVS、PVA以及 PLRV的基因組RNA保守序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)（表1）。反轉(zhuǎn)錄體系（20 μL）：病毒總 RNA 2.5 μL，20 pmol/L 病毒下游引物各0.5 μL，5×MMLV buffer（MBI）4 μL，20 U/μL RNA 抑制劑 （Rnasin，MBI）0.5 μL，200 U/μL MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV RT，MBI）1 μL，dNTPs分別選用 0.5、1、1.5 mmol/L，DEPC 處理水補(bǔ)足 20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 30 min，94℃ 5 min，4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在eppendorf PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行。

表1 用于RT-PCR反應(yīng)的4種馬鈴薯病毒引物對(duì)

1.4 PCR反應(yīng)

RCR 體系（總體積 25 μL）：取 4 μL合成的cDNA 作為反應(yīng)模板，10×PCR buffer（BioBRK）2.5 μL，5 u/μL Taq DNA 聚合酶 （BioBRK）0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，MgCl2分 別 選 用 2.5、3、3.5 mmol/L，20 pmol/L 4種病毒上游引物和下游引物各1 μL，雙蒸水補(bǔ)足 25 μL。退火溫度從 57℃設(shè)到61℃；PCR反應(yīng)條件是94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，設(shè)置為 30 個(gè)循環(huán)、35 個(gè)循環(huán)、40個(gè)循環(huán)、45個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min；PCR反應(yīng)在eppendorf PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 三重RT-PCR的組合

三重 RT-PCR檢測(cè) PVX、PVS、PVA和 PLRV共有 4種組合方式，分別是：（1）PVX、PVS和 PVA；（2）PVX、PVS 和 PLRV；（3）PVX、PVA 和 PLRV；（4）PVS、PVA和PLRV。每一種組合的反應(yīng)體系都從dNTPs濃度對(duì)反體轉(zhuǎn)錄的影響、退火溫度對(duì)PCR的影響、Mg2+濃度對(duì)PCR的影響和反應(yīng)程序?qū)CR的影響4個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 RT-PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

RT-PCR產(chǎn)物切膠回收后，按標(biāo)準(zhǔn)方法克隆到PGM-T中，PCR法篩選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒DNA，酶切驗(yàn)證后分別測(cè)序（上海英俊生物技術(shù)有限公司）。

2 結(jié)果與分析

2.1 反轉(zhuǎn)錄（RT）

反轉(zhuǎn)錄體系中dNTPs濃度為0.5、1、1.5 mmol/L時(shí)，對(duì)三重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)PVX、PVA和PLRV的影響如圖1-A所示，當(dāng)dNTPs小于1 mmol/L，PVA擴(kuò)增靶帶很弱；當(dāng)dNTPs濃度為1～1.5 mmol/L時(shí)能擴(kuò)增出PVX、PVA、PLRV這3種病毒的靶標(biāo)條帶；當(dāng)dNTPs濃度為1.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果最好。三重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)PVS、PVA和PLRV的影響如圖1-B所示，dNTPs濃度為0.5～1.5 mmol/L都能擴(kuò)增出3種病毒條帶。

圖1 dNTPs濃度的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用的是兩步法二重RT-PCR，首先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后取一部分cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果反轉(zhuǎn)錄沒(méi)有合成cDNA或合成的較少，將直接影響到PCR擴(kuò)增的效果，所以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相對(duì)較為重要[1]?？芍?，dNTPs濃度是影響反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)重要的因素。

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

2.2.1 退火溫度對(duì)PCR的影響 如圖2-A所示，退火溫度從58℃到62℃都能同時(shí)擴(kuò)增出PVX、PVS、PLRV 3種病毒；從圖2-B可知，當(dāng)退火溫度達(dá)到61℃時(shí)，三重RT-PCR僅能擴(kuò)增出PVS和PVA兩種病毒。當(dāng)退火溫度為60℃時(shí)，病毒的三條靶標(biāo)條帶清晰且亮度高，擴(kuò)增效果最好。所以，退火溫度對(duì)PCR也有一定的影響。

圖2 退火溫度的優(yōu)化

2.2.2 Mg2+濃度對(duì)PCR的影響 PCR體系中Mg2+濃度為2.5、3.0、3.5 mmol/L時(shí)，對(duì)三重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)PVA、PVY和PLRV的影響如圖3-A所示，當(dāng)Mg2+濃度為2.5 mmol/L時(shí)，無(wú)法擴(kuò)增出PVA，只能擴(kuò)增出PVS和PLRV的靶標(biāo)條帶；當(dāng)Mg2+濃度增為3 mmol/L，能同時(shí)擴(kuò)增出PVS、PVA、PLRV 3種病毒的靶標(biāo)條帶；再繼續(xù)增大Mg2+濃度，對(duì)3種病毒的擴(kuò)增效果不好。如圖3-B所示，Mg2+濃度為2.5、3.0、3.5 mmol/L 時(shí)，都能同時(shí)擴(kuò)增出 PVX、PVS、PVA的靶標(biāo)條帶，當(dāng)Mg2+濃度增為3 mmol/L，擴(kuò)增效果最好。因此，Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響較大。

圖3 MgCl2濃度的優(yōu)化

2.3 反應(yīng)程序

如圖4-A所示，PCR的循環(huán)數(shù)從30到45均能同時(shí)擴(kuò)增出PVX、PVS和PVA，但是當(dāng)循環(huán)數(shù)目小于30時(shí)，PVA的目的條帶不明顯；當(dāng)循環(huán)數(shù)目大于40時(shí)，PVA的目的條帶非常微弱；效果較好的是35個(gè)循環(huán)。從圖4-B，可知PCR的循環(huán)數(shù)從30到45均能同時(shí)擴(kuò)增出PVX、PVA和PLRV，擴(kuò)增效果差異不大。總的來(lái)說(shuō)，反應(yīng)程序?qū)φ麄€(gè)反應(yīng)影響不大。

圖4 循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

2.4 RT-PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序

切膠回收 PVX、PVS、PVA和 PLRV的 RTPCR產(chǎn)物，克隆到PGM-T載體中，通過(guò)PCR驗(yàn)證得到的白色菌落分別含有以上幾種病毒的cDNA，提取質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI BLAST報(bào)道的病毒基因序列對(duì)比，PLRV的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與NCBI BLAST報(bào)道的相應(yīng)病毒的序列同源性達(dá)到100%；PVA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與NCBI BLAST報(bào)道的PVA病毒的序列同源性達(dá)到99%；PVS的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與NCBI BLAST報(bào)道的PVS病毒的序列同源性達(dá)到98%；PVX的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與NCBI BLAST報(bào)道的PVX病毒的序列同源性達(dá)到96%。

3 討論

傳統(tǒng)的指示植物法檢測(cè)病毒費(fèi)時(shí)費(fèi)力且靈敏度低，目前應(yīng)用最廣的是以病毒抗血清為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)病毒。ELISA法比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法靈敏度提高了許多，但存在著假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象，也無(wú)法區(qū)分因外殼蛋白基因有一定同源性的病毒類(lèi)型[2]，并且不足以檢測(cè)含量極少的韌皮部病毒及休眠種薯中的病毒。近年來(lái)發(fā)展的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法因其具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在植物病毒的檢測(cè)上顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)[3]。在國(guó)內(nèi)外已有單一RT-PCR檢測(cè)PVY、PLRV、PSTVd等的應(yīng)用。

在RT-PCR中使用一對(duì)以上的引物就稱之為多重RT-PCR，它能夠同時(shí)擴(kuò)增目的DNA中的幾個(gè)片段，以節(jié)省模板、時(shí)間和減少費(fèi)用。設(shè)置多重PCR反應(yīng)體系必須確保反應(yīng)中所有的引物有相近的熔解溫度，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)該大小相近但又能夠通過(guò)電泳分開(kāi)。本研究設(shè)計(jì)的這4種病毒的引物，基本滿足以上條件；并且從退火溫度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、循環(huán)條件4方面優(yōu)化反應(yīng)條件，將其應(yīng)用于同時(shí)擴(kuò)增3種病毒已成功實(shí)現(xiàn)。與單重RT-PCR相比，三重RT-PCR更適合于檢測(cè)田間復(fù)合侵染的多種病毒，可以大大簡(jiǎn)化病毒檢測(cè)的工作量，又能進(jìn)一步降低成本，更有利于馬鈴薯種苗病毒實(shí)際檢測(cè)，對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐有著非常重要的意義。研究結(jié)果表明，采用該反應(yīng)程序可以穩(wěn)定性地檢出田間自然感染的幾種主要馬鈴薯病毒。并可以此研究結(jié)果為基礎(chǔ)，對(duì)反應(yīng)體系做進(jìn)一步的優(yōu)化，建立四重RTPCR同時(shí)檢測(cè)多種馬鈴薯病毒的技術(shù)。

[1]袁 青，殷幼平，王中康.二重RT-PCR快速檢測(cè)馬鈴薯病毒的方法[J].植物檢疫，2005，19（3）：135-138.

[2]Jelkmann W,Keimkonrad R.An immuno-capture polymerase chain reaction and plate-trapped ELISA for the detection of apple stem spitting virus[J].Phytopathology,1997,145:499-504.

[3]李浩戈，吳元華，趙秀香.馬鈴薯Y病毒的RT-PCR檢測(cè)[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990；30（3）：244-246.