周映華，吳勝蓮，賀月林，繆 東

（湖南省微生物研究所，湖南 長沙 410009）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）基我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，已被越來越多的研制成微生物制劑。其制劑是無毒、無殘留、無污染的“綠色”添加劑，具有廣闊的發(fā)展前景，現(xiàn)已在畜牧業(yè)、飼料行業(yè)中廣泛應用，顯示出了巨大的社會效益和生態(tài)效益?？莶菅挎邨U菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能產(chǎn)生抗菌素，在動物腸道內具有較強生物奪氧能力，這些特性對促進動物營養(yǎng)的消化吸收、提高動物的飼料轉化率和防病，促進生長起到重要作用。目前在工業(yè)化生產(chǎn)中，仍然存在發(fā)酵周期長、芽孢形成率低、成本高等問題。筆者對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了研究，以期提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 供試菌種為枯草芽孢桿菌，由湖南省微生物研究所菌種保藏室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 檢測培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，葡萄糖1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%；種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，pH 7.0～7.2；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、大豆粕1%、淀粉0.3%、3.08%濃度的硫酸錳溶液0.1%。pH均調為7.0～7.2。

1.1.3 儀器設備 供試儀器：SHP-250生化培養(yǎng)箱、1600倍微生物顯微鏡、PHS—25型數(shù)顯酸度計、?，擰YC—211搖床、電熱鼓風干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用四因素三水平L9（34）的正交實驗，對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，通過稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，芽孢率采用芽孢染色后顯微鏡下計數(shù)比較。光密度（OD600）值測定采用光電比濁計數(shù)法，以活菌數(shù)的高低作為評價培養(yǎng)基優(yōu)劣的指標。

1.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化 （1）溫度對生長量的影響：選取20、25、30、35、37、40℃ 6 個溫度作為搖床發(fā)酵溫度，在初始pH 7.0，轉速220 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定其OD600值。（2）起始pH值對生長量的影響：將培養(yǎng)基的初始 pH 調至 5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0，在接種量5%，溫度30℃，轉速220 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定其OD600值。（3）轉速對生長量的影響：選取 150、200、220、250、300 r/min 5個轉速，在發(fā)酵液初始pH 7.2，溫度30℃條件下培養(yǎng)24 h，測定其OD600值。（4）接種量對生長量的影響：選取接種量 1%、3%、5%、7%、10%、15%，在30℃，初始pH 7.2，轉速220 r/min條件培養(yǎng)24 h，測定其OD600值。

1.2.3 發(fā)酵罐試驗 在搖瓶優(yōu)化的基礎上，進行了20 L發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：初始pH 7.0～7.2，溫度 30℃，轉速 220 r/min，121℃滅菌30 min，起始氣流量比l∶0.5。鏡檢芽孢率達到85%以上時，發(fā)酵結束。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

由表1可見，對枯草芽孢桿菌發(fā)酵影響的次序為：豆粕＞淀粉＞葡萄糖＞硫酸錳，即豆粕對菌體增殖的影響最大，其次是淀粉、葡萄糖，最后為硫酸錳。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、3.08%硫酸錳0.2ml、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%。

表1 正交試驗

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 溫度對生長量的影響 由圖1可見，在20～30℃時，隨著溫度的升高，OD600值升高。在30℃時OD600值最大，高于30℃時，OD600值反而下降，因而枯草芽孢桿菌的最適生長溫度為30℃。

圖1 不同溫度對枯草芽孢桿菌生長量的影響

2.2.2 起始pH值對生長量的影響 發(fā)酵過程中pH難以控制，一般控制發(fā)酵液的初始pH。由圖2可見，枯草芽孢桿菌的適宜pH范圍為7.0～7.2。

2.2.3 轉速對生長量的影響 枯草芽孢桿菌是需氧菌，通過改變轉速可以調節(jié)通氣量。轉速太小，通氣量小，不利于菌體生長，轉速太大時，菌體生長量反而減少。由圖3可見，隨著轉速的提高，OD600值升高。超過220 r/min后，其OD600值反而下降?？莶菅挎邨U菌的最適轉速為220 r/min。

圖2 不同pH對枯草芽孢桿菌生長量的影響

圖3 不同轉速對枯草芽孢桿菌生長量的影響

2.2.4 接種量對生長量的影響 由圖4可見，隨著接種量的增加，其OD600值升高，超過10%的接種量后，OD600值反而下降，因此枯草芽孢桿菌的最適接種量為10%。

圖4 不同接種量對生長量的影響

2.3 發(fā)酵罐試驗

發(fā)酵罐試驗結果表明：發(fā)酵周期與搖瓶發(fā)酵基本一致，含菌量達1.58×1010個/mL，放罐時間20～22 h。由于發(fā)酵罐的攪拌和通氧條件均優(yōu)于搖瓶發(fā)酵，因此菌體濃度和芽孢形成率都比搖瓶發(fā)酵好。

3 結論

采用正交實驗法對枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，通過稀釋平板計數(shù)法測定其培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)，以活菌數(shù)的高低作為評價培養(yǎng)基優(yōu)劣的指標。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、3.08%硫酸錳0.2 mL。并通過單因素實驗法確定了最佳培養(yǎng)條件為：溫度30℃，初始 pH 7.0～7.2，轉速 220 r/min，接種量 10%。進行了發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，最適放罐時間20～22 h，獲得的菌體數(shù)量約為1.58×1010個/mL，為大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)提供了有益借鑒。

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