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        飼用枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

        2010-07-09 13:00:04周映華吳勝蓮賀月林
        湖南農(nóng)業(yè)科學 2010年11期
        關鍵詞:優(yōu)化影響

        周映華,吳勝蓮,賀月林,繆 東

        (湖南省微生物研究所,湖南 長沙 410009)

        枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一,已被越來越多的研制成微生物制劑。其制劑是無毒、無殘留、無污染的“綠色”添加劑,具有廣闊的發(fā)展前景,現(xiàn)已在畜牧業(yè)、飼料行業(yè)中廣泛應用,顯示出了巨大的社會效益和生態(tài)效益??莶菅挎邨U菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性,能產(chǎn)生抗菌素,在動物腸道內具有較強生物奪氧能力,這些特性對促進動物營養(yǎng)的消化吸收、提高動物的飼料轉化率和防病,促進生長起到重要作用。目前在工業(yè)化生產(chǎn)中,仍然存在發(fā)酵周期長、芽孢形成率低、成本高等問題。筆者對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了研究,以期提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌 種 供試菌種為枯草芽孢桿菌,由湖南省微生物研究所菌種保藏室提供。

        1.1.2 培養(yǎng)基 檢測培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,葡萄糖1%,氯化鈉0.5%,瓊脂2%;種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化鈉0.5%,pH 7.0~7.2;基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、大豆粕1%、淀粉0.3%、3.08%濃度的硫酸錳溶液0.1%。pH均調為7.0~7.2。

        1.1.3 儀器設備 供試儀器:SHP-250生化培養(yǎng)箱、1600倍微生物顯微鏡、PHS—25型數(shù)顯酸度計、?,擰YC—211搖床、電熱鼓風干燥箱等。

        1.2 方法

        1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用四因素三水平L9(34)的正交實驗,對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)24 h后,通過稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù),芽孢率采用芽孢染色后顯微鏡下計數(shù)比較。光密度(OD600)值測定采用光電比濁計數(shù)法,以活菌數(shù)的高低作為評價培養(yǎng)基優(yōu)劣的指標。

        1.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化 (1)溫度對生長量的影響:選取20、25、30、35、37、40℃ 6 個溫度作為搖床發(fā)酵溫度,在初始pH 7.0,轉速220 r/min條件下培養(yǎng)24 h,測定其OD600值。(2)起始pH值對生長量的影響:將培養(yǎng)基的初始 pH 調至 5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0,在接種量5%,溫度30℃,轉速220 r/min條件下培養(yǎng)24 h,測定其OD600值。(3)轉速對生長量的影響:選取 150、200、220、250、300 r/min 5個轉速,在發(fā)酵液初始pH 7.2,溫度30℃條件下培養(yǎng)24 h,測定其OD600值。(4)接種量對生長量的影響:選取接種量 1%、3%、5%、7%、10%、15%,在30℃,初始pH 7.2,轉速220 r/min條件培養(yǎng)24 h,測定其OD600值。

        1.2.3 發(fā)酵罐試驗 在搖瓶優(yōu)化的基礎上,進行了20 L發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為:初始pH 7.0~7.2,溫度 30℃,轉速 220 r/min,121℃滅菌30 min,起始氣流量比l∶0.5。鏡檢芽孢率達到85%以上時,發(fā)酵結束。

        2 結果與分析

        2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

        由表1可見,對枯草芽孢桿菌發(fā)酵影響的次序為:豆粕>淀粉>葡萄糖>硫酸錳,即豆粕對菌體增殖的影響最大,其次是淀粉、葡萄糖,最后為硫酸錳。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、3.08%硫酸錳0.2ml、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%。

        表1 正交試驗

        2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

        2.2.1 溫度對生長量的影響 由圖1可見,在20~30℃時,隨著溫度的升高,OD600值升高。在30℃時OD600值最大,高于30℃時,OD600值反而下降,因而枯草芽孢桿菌的最適生長溫度為30℃。

        圖1 不同溫度對枯草芽孢桿菌生長量的影響

        2.2.2 起始pH值對生長量的影響 發(fā)酵過程中pH難以控制,一般控制發(fā)酵液的初始pH。由圖2可見,枯草芽孢桿菌的適宜pH范圍為7.0~7.2。

        2.2.3 轉速對生長量的影響 枯草芽孢桿菌是需氧菌,通過改變轉速可以調節(jié)通氣量。轉速太小,通氣量小,不利于菌體生長,轉速太大時,菌體生長量反而減少。由圖3可見,隨著轉速的提高,OD600值升高。超過220 r/min后,其OD600值反而下降??莶菅挎邨U菌的最適轉速為220 r/min。

        圖2 不同pH對枯草芽孢桿菌生長量的影響

        圖3 不同轉速對枯草芽孢桿菌生長量的影響

        2.2.4 接種量對生長量的影響 由圖4可見,隨著接種量的增加,其OD600值升高,超過10%的接種量后,OD600值反而下降,因此枯草芽孢桿菌的最適接種量為10%。

        圖4 不同接種量對生長量的影響

        2.3 發(fā)酵罐試驗

        發(fā)酵罐試驗結果表明:發(fā)酵周期與搖瓶發(fā)酵基本一致,含菌量達1.58×1010個/mL,放罐時間20~22 h。由于發(fā)酵罐的攪拌和通氧條件均優(yōu)于搖瓶發(fā)酵,因此菌體濃度和芽孢形成率都比搖瓶發(fā)酵好。

        3 結論

        采用正交實驗法對枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,通過稀釋平板計數(shù)法測定其培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù),以活菌數(shù)的高低作為評價培養(yǎng)基優(yōu)劣的指標。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為:葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、3.08%硫酸錳0.2 mL。并通過單因素實驗法確定了最佳培養(yǎng)條件為:溫度30℃,初始 pH 7.0~7.2,轉速 220 r/min,接種量 10%。進行了發(fā)酵罐放大培養(yǎng),最適放罐時間20~22 h,獲得的菌體數(shù)量約為1.58×1010個/mL,為大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)提供了有益借鑒。

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