陳松波，龔 麗，劉海金

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100039）

微衛(wèi)星（Microsatellites）也叫簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），是目前穩(wěn)定性和多態(tài)性相對較高、具共顯性、分布均勻且數(shù)量豐富的一種分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于動植物的遺傳研究和育種實踐中。例如構(gòu)建遺傳圖譜[1]、進(jìn)行QTL定位[2]、親緣關(guān)系鑒定[3-4]及遺傳多樣性分析[5-6]等。傳統(tǒng)上，分離SSR標(biāo)記是依賴于對基因組文庫的構(gòu)建，采用的是重復(fù)序列探針和陽性克隆測序來開發(fā)基因座上的特定引物。這種方法雖適用于許多生物，但是由于技術(shù)復(fù)雜，費時費力，反而限制了基因組SSR的進(jìn)一步利用。

隨著國際公共數(shù)據(jù)庫中基因組DNA序列激增，表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）自1991年起也呈指數(shù)增長趨勢。而大多數(shù)表型差異基本上是DNA水平上變化引起的，特別是表達(dá)基因的堿基序列，因此，通過搜索現(xiàn)成的數(shù)據(jù)庫來發(fā)掘SSR標(biāo)記，極大地縮短了標(biāo)記開發(fā)時間，同時節(jié)省了大量經(jīng)費。目前從EST中開發(fā)SSR標(biāo)記正成為新標(biāo)記開發(fā)的焦點，尤其是在植物上已開展了多個物種EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用，如西瓜[7]、白菜[8]、油菜[9]、香菇[10]、柑橘[11]等。自2000年起，也相繼展開了從魚類（如羅非魚[12]），貝類（如海灣扇貝（Argopecten irradians）[13]）及蝦類（如中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）[14]）的EST中開發(fā)SSR標(biāo)記的研究。Serapion等2004年就曾報道從斑點叉尾（Ictalurus punctatus）數(shù)據(jù)庫中采用生物信息學(xué)方法開發(fā)EST-SSRs的研究[15]。Yue等從鯉魚部分EST數(shù)據(jù)庫采集數(shù)據(jù)開發(fā)出一些EST-SSR標(biāo)記，并將這些標(biāo)記應(yīng)用于銀鯽的遺傳性分析[16]。本研究將對NCBI數(shù)據(jù)庫中所有牙鲆（Paralichthys olivaceus）EST序列進(jìn)行SSR檢索，并分析ESTSSR分布的頻率及堿基重復(fù)特點，為牙鲆ESTSSR的遺傳分布規(guī)律提供一個基本的認(rèn)識，并為牙鲆EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用研究提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 牙鲆EST來源

從 NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）中搜索所有牙鲆的EST序列，搜索結(jié)果均以FASTA格式顯示，并且以文本文件的格式保存，用于生物信息學(xué)分析。

1.2 EST的預(yù)處理

對檢索到的EST序列采用VectorNTI Contig-Express軟件進(jìn)行重疊群分析和聚類以去除冗余序列，除去5'端或3'端的polyT或polyA，初始裝配參數(shù)為最小重復(fù)堿基數(shù)（Minmatch）為20，最小得分值（Minscore）為40，每一個聚類需經(jīng)過檢查以確保其準(zhǔn)確度，從而避免由微衛(wèi)星重復(fù)基元和長字符串引起的假聚類。

1.3 牙鲆EST中SSR的篩選

在線（http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool）對聚類后的EST進(jìn)行微衛(wèi)星序列搜索。選取重復(fù)次數(shù)在6次及以上的雙堿基重復(fù)序列，5次及以上的三堿基重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)在4次以上的四堿基和五堿基重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)在3次以上的六堿基重復(fù)序列均為完全重復(fù)，并對搜索出的SSR的頻率與長度進(jìn)行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆EST-SSRs的分布頻率

本研究共搜索到8 842條牙鲆ESTs序列，這些序列來自其頭、腎、肝臟、脾臟、肌肉、心臟、腦、腸、胃、卵巢、皮膚等多個組織的cDNA克隆。經(jīng)聚類和組合后，共得到5 927條無冗余EST序列，總長度為3.72×106bp，平均長度為627 bp。在線進(jìn)行SSR的搜索結(jié)果表明，這些無冗余的EST序列共發(fā)現(xiàn)分布于390條EST中的471個SSR，平均7.9 kb出現(xiàn)1個SSR，出現(xiàn)頻率為7.95%。在390條含有SSR的EST中，只含有1個SSR的EST有313條，含有2個SSR的有62條，含有3個SSR的有13條，含有4個SSR的有2條。SSR重復(fù)基元類型豐富，包括二堿基序列、三堿基序列、四堿基序列、五堿基序列和六堿基序列。重復(fù)基元含量最多的為二核苷酸重復(fù)，共有278個，所占比例達(dá)到全部SSR的59.02%，在全部EST中的出現(xiàn)頻率為4.69%；其次為三核苷酸重復(fù)，占全部SSR比例的26.33%，出現(xiàn)頻率為2.09%（見表1）。四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)類型很少，合計占所有類型的14.65%，其中五核苷酸序列重復(fù)類型最少，僅占0.21%。由此可見，在牙鲆EST-SSR中，二核苷酸重復(fù)占主導(dǎo)地位。

2.2 牙鲆EST-SSRs的特點

所篩選出的EST-SSRs共包括112種重復(fù)基元，其中二核苷酸重復(fù)基元10種，三核苷酸重復(fù)基元38種，四核苷酸重復(fù)基元34種，五核苷酸重復(fù)基元1種，六核苷酸重復(fù)基元29種（見表2）。

二核苷酸重復(fù)基元以AC最多，占二核苷酸重復(fù)基元類型的16.91%，其次是TG、CA、GT、TA、GA，分別占二核苷酸重復(fù)基元類型14.03%、13.67%、12.59%、9.71%和8.63%。三核苷酸重復(fù)基元、四核苷酸重復(fù)基元和六核苷酸重復(fù)基元種類較多，但核苷酸重復(fù)基元類型分布相對分散，出現(xiàn)頻率較低，所占比例也不高，其中三核苷酸重復(fù)基元GAG、CAG和CTG分別占所有三核苷酸重復(fù)基元類型的7.26%、6.45%和6.45%（見表3）。五核苷酸重復(fù)基元種類最少，僅出現(xiàn)（TTTAT）n一種重復(fù)。

表1 牙鲆EST中SSR出現(xiàn)的頻率Table 1 Occurrence frequency of SSRs in a set of Japanese flounder ESTs

表2 牙鲆EST-SSR的重復(fù)基元Table 2 Repeat motif of EST-SSRs in Japanese flounder

2.3 牙鲆EST-SSRs的理論多態(tài)性與可用性分析

牙鲆的基序長度主要集中在12～24 bp。18 bp的基序長度最多，有78個，包括9次重復(fù)的二核苷酸基元、6次重復(fù)的三核苷酸基元和3次重復(fù)的六核苷酸基元。其次是15 bp，數(shù)量為65個，系五次重復(fù)的三核苷酸基元?；蜃铋L的為132 bp，為二核苷酸基元的66次重復(fù)?；蜷L度在12～20 bp的 SSR占全部 SSR的 72.4%，20～30 bp的占17.41%，大于30 bp的占10.19%。

Temnykh等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SSR基序長度大于或等于20 bp時多態(tài)性較高，長度在12～20 bp之間的多態(tài)性中等，而長度在12 bp以下時多態(tài)性極低[17]。依照此標(biāo)準(zhǔn)可推測72.4%的牙鲆ESTSSR具有中等多態(tài)性，17.41%的EST-SSR具有較高多態(tài)性。本研究所得的主要基元是二、三核苷酸重復(fù)基元，均屬于低級基元，表明牙鲆的ESTSSR大部分具有高多態(tài)性潛能，并具有較高的可用性。

表3 主要二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元發(fā)生頻率Table 3 Frequency of main repeat motif in dinucleotide and trinucleotide

3 討 論

本研究分析了牙鲆EST序列中SSR的分布頻率和重復(fù)基元的特點，發(fā)現(xiàn)NCBI數(shù)據(jù)庫中大約有7.95%的牙鲆EST能夠檢索出SSR，這一比例低于斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）[18]（13.7%），紅旗東方（Fugu rubripes）[19（]11.5%）和斑點叉尾[15]（11.2%），但又高于櫛孔扇貝（Chlamys farreri）[20]（1.61%）、中國對蝦[14（]2.2%）、長牡蠣（Crassostrea gigas）[21]（3.63%）海灣扇貝[22]（3.9%）、真鯛（Chrysophrys major）[23]（4%）和鯉魚[24]（5.55%）。這些差異可能由EST-SSR在水產(chǎn)動物中高度的物種特異性引起，也可能是由于用來搜尋SSR的軟件不同，所設(shè)定的參數(shù)不同而造成的。

cDNA文庫的隨機序列使得EST中的冗余序列比例較高，為了降低分析數(shù)據(jù)的長度，應(yīng)消除冗余序列。本研究中，EST-SSRs的平均密度在去除冗余序列之前是11.54 kb，而去除之后，平均每7.9 kb出現(xiàn)1個SSR。因此，在非冗余EST序列中，SSRs的分布頻率能更準(zhǔn)確地反映其在轉(zhuǎn)錄基因組中的密度。

本研究發(fā)現(xiàn)牙鲆EST-SSR重復(fù)基元以二核苷酸為最多，占所有SSR的59.02%，其次是三核苷酸重復(fù)，占所有SSR的26.33%，這與中國對蝦[25]的研究結(jié)果相一致，而大多數(shù)植物的EST-SSR都以三核苷酸重復(fù)為主[26-27]。牙鲆二核苷酸重復(fù)中AC為優(yōu)勢基元，這與鯉魚[24]和斑點叉尾[15]的研究結(jié)果相一致。而在櫛孔扇貝中二核苷酸重復(fù)中出現(xiàn)頻率最高的為GC[20]，斑節(jié)對蝦中出現(xiàn)頻率最高的二核苷酸重復(fù)基元為AT[18]，長牡蠣[21]和美國黃金鱸[28]中以AG/CT重復(fù)基元的數(shù)量最多。在本研究的二核苷酸重復(fù)中各種類型的均具有，而長牡蠣中未檢測出CG重復(fù)[21]。這種不同物種EST-SSR主導(dǎo)類型的差異可能是由于各報道中所用EST來源和EST數(shù)目不同所致。牙鲆的三核苷酸重復(fù)基元、四核苷酸重復(fù)基元和六核苷酸基元種類繁多，分別為38、34和29種，但是基元分布相對分散。其中，三核苷酸重復(fù)基元略有優(yōu)勢的為GAG、CAG和CTG，所占比例僅為三核苷酸重復(fù)基元類型的7.26%、6.45%和6.45%，這說明堿基偏倚性不太明顯。

4 結(jié)論

牙鲆EST-SSR的出現(xiàn)頻率較高，且類型豐富。從多態(tài)性潛能角度考慮，這些EST-SSR也具有較高的可用性。本研究對牙鲆EST-SSR的遺傳分布特點進(jìn)行了歸納總結(jié)，為進(jìn)一步開發(fā)牙鲆ESTSSR標(biāo)記提供了基礎(chǔ)資料。EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)成本相對較低，且具有較高的通用性，因此，在親緣關(guān)系鑒定、群體遺傳學(xué)、比較基因組學(xué)以及功能基因組學(xué)等研究方面都具有重要的利用價值。

[1]孫效文,梁利群.鯉魚的遺傳連鎖圖譜（初報）[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2000,7(1):1-6.

[2]張研,梁利群,常玉梅,等.鯉魚體長性狀的QTL定位及其遺傳效應(yīng)分析[J].遺傳,2007,29(10):1243-1248.

[3]胡雪松,李池陶,馬波,等.3個德國鏡鯉養(yǎng)殖群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J].水產(chǎn)學(xué)報,2007,31(5):575-582.

[4]張勇,肖禮華,陳祥,等.用微衛(wèi)星標(biāo)記分析貴州地方雞種的遺傳多樣性及親緣關(guān)系[J].中國畜牧雜志,2009,45(23):1-6.

[5]盛云燕,欒非時,陳克農(nóng).甜瓜SSR標(biāo)記遺傳多樣性的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,37(2):165-170.

[6]楊靜,劉海英,錢春榮,等.黑龍江省水稻品種SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].2008,39(6):1-10.

[7]VermaM,AryaL.DevelopmentofEST-SSRsinwatermelon(Citrullus lanatus var.Lanatus)and their transferability to Cucumis spp.[J].Journal of Horticultural Science and Biotechnology,2008,83(6):732-736.

[8]忻雅,崔海瑞,盧美貞,等.白菜EST-SSR信息分析與標(biāo)記的建立[J].園藝學(xué)報,2006,33(3):549-554.

[9]李小白,張明龍,崔海瑞.油菜EST-SSR標(biāo)記的建立[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報,2007,40(2):137-144.

[10]林范學(xué),程水明,李安政,等.香菇EST-SSR引物篩選[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2007,15(2):358-359.

[11]Chen C X,Zhou P,Choi Y A,et al.Mining and characterizing microsatellites from citrus ESTs[J].Theor Appl Genet,2006,112:1248-1257.

[12]Yue G H,Orban L.Microsatellites from genes show polymorphism in two related Oreochromis species[J].Mol Ecol Notes,2002,2:99-100.

[13]Wan g L L,Song L S,Xu W,et al.Screening microsatellite markers from EST sequences of bay scallop Argopecten irmdians[J].High Technology Letters,2006,12(11):97-102.

[14]Wang H X,Li F H,Xiang J H.Polymorphic EST-SSR markers and their mode of inheritance in Fenneropenaeus chinensis[J].Aquaculture,2005,249:107-114.

[15]Serapion J,Kucuktas H,Feng J N,et al.Bioinformatic mining of type I microsatellites from expressed equence tags of channel catfish(Ictaluruspunctatus)[J].Mar Biotechnol,2004(6):364-377.

[16]Yue G H,Ho M Y,Orban L,et al.Microsatellites within genes and ESTs of common carp and their applicability in silver crucian carp[J].Aquaculture,2004,234:85-98.

[17]Temnykh S,DeClerck G,Lukashova A,et al.Computational and experimental analysis of microsatellites in rice(Oryza sativa L.):frequency,length variation,transposon associations,and genetic marker potential[J].Genome Research,2001(11):1441-1452.

[18]ManeeruttanarungrojC,PongsomboonS,WuthisuthimethaveeS,etal.Development of polymorphic expressed sequence tag derived microsatellites for the extension of the genetic linkage map of the black tiger shrimp(Penaeus monodon)[J].Anim Genet,2006,37:363-368.

[19]Edwards Y J,Elgar G,Clark M S,et al.The identification and characterization of microsatellites in the compact genome of the Japanese puffer fish,Fugu rubripes:Perspectives in functional and comparative genomic analyses[J].J Mol Biol,1998,278:843-854.

[20]Zhan A B,Bao Z M,Hu X L.Characterization of 95 novel microsatellitemarkersforZhikongscallop Chlamysfarreri usingFIASCO-colony hybridization and EST database mining[J].Fisheries Science,2008,74(3):516-526

[21]Yu H,Li Q.Exploiting EST databases for the development and characterization of EST-SSRs in the pacific oyster(Crassostrea gigas)[J].Journal of Heredity,2008,99(2):208-14

[22]Zhan A B,Bao Z M,Wang X L,et al.Microsatellite markers derived from bay scallop Argopecten irradians expressed sequence tags[J].Fish Sci,2005,71:1341-1346.

[23]Chen S L,Liu Y G,Xu M Y,et al.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from an EST library of red sea bream(Chrysophrys major)and cross-species amplification[J].Mol Ecol Notes,2005,5:215-217.

[24]Wang D,Liao X L,Cheng L,et al.Development of novel EST-SSR markers in common carp by data mining from public EST sequences[J].Aquaculture,2007,271:558-574

[25]徐鵬,周令華,田麗萍,等.從中國對蝦ESTs中篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2003,27(3):213-218.

[26]VarshneyRK,GranerA,SorrellsME.Genicmicrosatellitemarkers in plants:features and applications[J].TRENDS in Biotechnology,2005,23(1):48-55.

[27]李永強,李宏偉,高麗鋒,等.基于表達(dá)序列標(biāo)簽的微衛(wèi)星標(biāo)記（EST-SSRs）研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報,2004,5(1):91-95.

[28]Zhan A,Wang Y,Brown B,et al.Isolation and characterization of novel microsatellite markers for yellow perch(Perca flavescens)[J].Int J Mol Sci,2009,10(1):18-27.