曲步云，李海濤，李 明，高繼國

（東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性細菌，它廣泛分布于世界各地，從熱帶雨林到北極凍土帶。已經從許多材料上分離獲得該菌，如土壤、植物葉片、鮮水[1]、糞便[2]、動物活體[3]、食物、倉儲等，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3 000多種害蟲有活性[4]。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），也稱 δ-內毒素（Deltaendotoxin），它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切關系[5]。該殺蟲晶體蛋白分別由cry和cyt基因編碼。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一個ICPs基因，并于1985年發(fā)表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，截止目前至少已有447個ICPs基因被克隆和測序[6]。從Bt菌株中鑒定到的cry蛋白根據其氨基酸序列同源性的差異已多達59類（cry1～cry59）。因此，對殺蟲晶體蛋白的挖掘及研究具有非常重要的實際價值。

本研究中Bt Q-12菌株分離自遼寧省鞍山市千山土壤，經過PCR-RFLP鑒定出的含有cry1類基因，成功克隆出了一段cry1Ac全長序列，構建重組表達載體導入大腸桿菌并誘導其高效表達。本研究為進一步研究cry1Ac28蛋白功能和活性打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本文所用菌株和質粒見表1。

表1 菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、加水定容至1 000 mL、pH 7.2、121℃、高壓滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基加入1.3%瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶、限制性核酸內切酶、dNTP（購自TaKaRa公司）；PCR引物（由上海生工公司合成），DNA凝膠回收試劑盒和DNA連接酶（購自上海生工公司）；其他藥品均為國產分析純以上產品。

1.2 方法

1.2.1 Bt Q-12菌株晶體形態(tài)的觀察

將Bt Q-12菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72 h后，進行涂片、烘干固定，石碳酸復紅染液染色3 min，清水沖洗，100倍油鏡進行鏡檢。

1.2.2 Bt Q-12菌株生長曲線測定

將Bt Q-12菌株接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基試管中30℃，230 r·min-1活化過夜，1%轉接到LB液體培養(yǎng)基中，30℃，230 r·min-1培養(yǎng)，每隔2 h取1 mL菌液測OD600的吸光值，OD值大于1時稀釋10倍測定。以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制生長曲線圖。

1.2.3 cry1Ac全長基因的PCR擴增

大腸桿菌質粒DNA的提取、DNA的酶切、連接、感受態(tài)的制備、轉化和表達產物SDS-PAGE檢測參照文獻[7]進行。PCR產物回收和純化參照上海生工PCR產物回收試劑盒說明書。PCR-RFLP體系鑒定Bt cry基因和陽性轉化子的篩選參照宋福平等方法進行[8]。

根據Bt命名中心已公布的cry1Ac類基因的全長序列[9]，通過其同源性的比較，設計出用于擴增全長序列的引物。

上游引物（Q5unx）：5′CGCGGATCCATGGAT AACAATCCGAACATC3′（Bam HⅠ）

下游引物（Q3unx）：5′ACGCGTCGACCTATT CCTCCATAAGGAGTA3′（SalⅠ）

PCR熱循環(huán)參數(shù)：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃聚合3 min，循環(huán)30次；72℃聚合10 min。取8 μL PCR產物于0.7%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測PCR產物。

1.2.4 原核表達載體的構建

回收cry1Ac類基因的全長PCR產物，分別對PCR產物和pEB載體用Bam HⅠ和SalⅠ進行雙酶切并回收，4℃連接過夜。將CaCl2法轉化制備的感受態(tài)E.coli JM109，涂布在氨芐抗性的LB平板上，37℃、12 h，PCR鑒定及酶切分析，篩選出含cry1Ac基因的陽性重組質粒。

1.2.5 序列測定及分析

由上海生工生物工程有限公司完成序列測定，采用NCBI Balst、DNAMAN等軟件分析序列。

1.2.6 cry1Ac基因的誘導表達

將獲得的陽性重組質粒轉化到感受態(tài)E.coli BL21（DE3）中，210 r·min-1、37 ℃培養(yǎng)至 OD600達到0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1進行誘導表達，37℃過夜培養(yǎng)，收集誘導培養(yǎng)物，離心收集沉淀。SDS-PAG檢測表達產物。同時用0.5 mmol·L-1IPTG 誘導 BL21（DE3）空菌株和含 pEB 空載體的菌株、未誘導含pEB空載體的菌株作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 Bt Q-12菌株生物學特性的分析

2.1.1 Bt Q-12菌株伴胞晶體形態(tài)的觀察

Bt Q-12在LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h可見菌落呈乳白色，表面粗糙不透明，邊緣不整體。挑取單菌落少量，制片，油鏡下觀察，可見伴胞晶體形態(tài)為大小不一的菱形（見圖1）。

由圖1可知，伴胞晶體的形態(tài)因cry基因的不同而不同，因此，根據顯微形態(tài)的觀察，可以初步推測菌株所含基因類型，從而推測Bt Q-12菌株含有cry1類基因。

2.1.2 Bt Q-12菌株生長曲線測定

菌株Bt Q-12的生長曲線如圖2所示，在2～6 h處于對數(shù)生長期，14～18 h進入生長穩(wěn)定期，穩(wěn)定期的OD600值約為3.5，與其他Bt菌株相比沒有太大差別。

圖1 Bt Q-12菌株的晶體形態(tài)Fig.1 Crystal shape of Bt Q-12

圖2 菌株Bt Q-12的生長曲線Fig.2 Growth curve of Bt Q-12

2.2 Bt Q-12菌株cry基因類型的鑒定

對菌株Q-12進行基因型的PCR-RFLP鑒定，采用特異引物K5un2/K3un2獲得了大小為1.6 kb的PCR產物（見圖3）。將1.6 kb的PCR產物進行PstⅠ/XbaⅠ酶切，獲得了cry1基因的RFLP圖譜（見圖4），從圖4可以看出，擴增獲得的1.6 kb PCR產物經酶切后產生了4個酶切片段，大小分別為1 117、802、518和322 bp。根據宋福平等的研究結果（見表2）[8]，說明其含有cry1Aa和cry1Aa基因。將PCR產物克隆至pMD18-T載體，通過K5un2/K3un2引物PCR篩選，得到陽性克隆子并測序。測序結果經NCBI Blast比對，確定該因核苷酸序列與cry1Aa最為相似，相似度為97%。

圖3 pMD18-T-cry1Ac的酶切分析與PCR鑒定Fig.3 Restriction analysis and PCR detection of pMD18-T-cry1Ac

圖4 Bt Q-12菌株cry1的PCR-RFLP酶切電泳檢測Fig.4 PCR-RFLP detection of cry1 from Bt Q-12

表2 cry1類的PCR擴增產物和限制性酶切長度多態(tài)性Table 2 Size of PCR products and their PCR-RFLP patterns of cry1 genes

2.3 cry1Ac全長基因的克隆

用引物Q5unx/Q3unx擴增得到cry1Ac 3.5 kb的全長基因，用Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切全長PCR產物和載體pEB，回收、連接、轉化JM109，經抗性篩選、PCR鑒定及酶切分析，篩選出含基因的陽性重組質粒。圖4為陽性重組質粒酶切分析及PCR鑒定結果，經Bam HⅠ和SalⅠ酶切后，得到大小為5.7 kb的載體條帶和3.5 kb全長基因條帶，說明該表達載體構建正確，該表達載體命名為pEB-cry1Ac。

2.4 cry1Ac全長序列及同源性分析

結果見圖5、6。

圖5 cry1Ac28蛋白的氨基酸組成Fig.5 Amino acids composition of cry1Ac28 protein

通過DNAMAN軟件分析Bt菌株Q-12編碼區(qū)長3537 bp。由DNA序列推導的氨基酸為1 178個，其中在其編碼的蛋白質的氨基酸組成中，親水性氨基酸占33.1%，疏水性氨基酸占43.0%，酸性氨基酸占12.9%，堿性氨基酸占11.0%。蛋白質的分子質量為 133.3176 ku，亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）三種氨基酸含量最高，分別為8.06%、7.80%和7.72%（見圖5），等電點為4.885（見圖6），為弱酸性蛋白質。該基因已在國際基因庫GenBank中注冊，登記號為FJ610439，并經Bt δ-內毒素基因國際命名委員會正式命名為cry1Ac 28。

圖6 cry1Ac28蛋白滴定曲線Fig.6 Titration curve of cry1Ac28 protein

NCBI Blast比對該蛋白序列與其他cry1Ac基因氨基酸的差異見表3。cry1Ac28與其他cry1Ac基因比較，在結構域Ⅰ、結構域Ⅱ存在一些差異，結構域Ⅲ與大部分cry1Ac基因相同。其中與cry1Ac23差異最大，結構域Ⅰ存在9個差異，結構域Ⅱ存在8個差異，結構域Ⅲ存在4個差異。同時NCBI Conserved Domain Summary分析結果表明，該蛋白的DomainⅠ由N端第36～254位，共218氨基酸組成；DomainⅡ由第259～461位，共202個氨基酸組成；DomainⅢ由第470～608位，共138個氨基酸組成。因此，cry1Ac蛋白的活性區(qū)估計在N-端的36～608個氨基酸附近。

2.5 cry1Ac28基因在E.coli BL21(DE3)中的表達

將重組質粒pEB-cry1Ac轉化到E.coli BL21（DE3）中，誘導表達，收集誘導物離心棄上清，SDS-PAGE（8%）。結果表明，含有pEB-cry1Ac的BL21（DE3）菌在130 ku處有一特異的蛋白帶，與預期的分子質量一致，而經IPTG誘導的BL21（DE3）空菌株和含pEB空載體的菌株沒有特異的目的帶產生（見圖7）。應用TANON公司凝膠定量軟件GIS3.74分析，cry1Ac28的表達量占菌體總蛋白的18.2%。

表3 cry1Ac28與其他cry1Ac基因氨基酸差異比較Table 3 Comparison of amino acid sequence between cry1Ac28 and other cry1Ac

圖7 cry1Ac28在BL21(DE3)中表達蛋白的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE protein which cry1Ac28 expressed in BL21(DE3)

3 討論

自1985年Adang等首次從蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）HD73中克隆了第一個Bt cry1Ac基因（即新的命名系統(tǒng)中的cry1Ac1）以來[10]，國際上已有29個cry1Ac（cry1Ac1-29）基因被陸續(xù)克隆和測序。

本研究從實驗室分離保存的蘇云金芽孢桿菌分離株中選擇Q-12野生菌株進行生物學特性鑒定，此野生菌株在LB培養(yǎng)基中產生的菱形晶體特別多，而且重復性強，菱形晶體蛋白對鱗翅目昆蟲具有特異性，研究這菌株的生物學特性，對獲得高毒性的殺鱗翅目的新的Bt菌株具有重要價值。

菌株的伴胞晶體形狀與殺蟲晶體蛋白的類型有關，cry1類殺蟲晶體蛋白的伴胞晶體形狀多為菱形，cry3類蛋白的殺蟲晶體蛋白的伴胞晶體多為方形，而鞘翅目害蟲蠐螬和雙翅目害蟲特異的cry8類蛋白的殺蟲晶體蛋白的伴胞晶體多為球形[11]。由此可見，伴胞晶體的形態(tài)因cry基因的不同而不同，根據顯微形態(tài)的觀察，可以初步推測菌株所含基因類型。本試驗首先通過鏡檢觀察Q-12具有菱形伴胞晶體就可初步推測其含有cry1基因。因此，在對具有未知殺蟲基因經進行鑒定之前，仔細分析菌株的殺蟲蛋白晶體特點對其進一步研究極其重要。

該基因表達載體的構建是應用的多功能高效表達載體pEB。pEB是利用引物從克隆表達重組蛋白功能最強大的系統(tǒng)pETblue-2質粒上擴增出該質粒的表達區(qū)。目的基因被克隆到pEB質粒載體上，受噬菌體T7啟動子強轉錄及翻譯信號控制，表達由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導。T7RNA聚合酶機制十分有效并具選擇性，在IPTG充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白，誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。該載體的另一個重要優(yōu)點是在非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉錄。故在本試驗中我們選擇了pEB作為表達載體，研究結果表明cry1Ac28基因在pEB中能實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的表達。可見在做原核表達之前選擇表達系統(tǒng)（受體菌和表達載體）非常重要。另外，在選擇了合適表達載體的基礎上，對誘導溫度、IPTG濃度、誘導時間和搖床轉速等條件進行優(yōu)化后能提高目的蛋白的表達量。本試驗之前在37℃條件下，可溶性蛋白極少，之后改變溫度將誘導溫度選擇在20℃，降低IPTG濃度，延長誘導時間，并選擇較低的搖床轉速等。

對cry1Ac28蛋白的生物信息學分析研究揭示出了與其他已知的cry1Ac基因的氨基酸序列在結構域Ⅰ、結構域Ⅱ存在一些差異，結構域Ⅲ與大部分cry1Ac基因相同，說明來自不同國家和地區(qū)的菌株所含的同一亞類基因保守性較強。結構域Ⅰ位于殺蟲晶體蛋白的N端是疏水的部分，具有α-螺旋結構，是發(fā)揮特異毒力的功能區(qū)域[12]。任羽等研究結果表明[13]，在結構域Ⅰ中的突變更容易產生活性提高的突變蛋白，而結構域Ⅱ和Ⅲ較難獲得毒力提高的突變蛋白，由此可以預測cry1Ac28蛋白也可能是高毒力蛋白。進一步研究cry1Ac28蛋白的構象及殺蟲活性，對擴大Bt菌株的殺蟲譜、增強菌株毒力、構建高效廣譜殺蟲Bt工程菌均具有現(xiàn)實意義。

4 結論

本研究以本實驗室分離的Bt菌株Q-12為研究對象，經過PCR-RFLP鑒定出的含有cry1類基因，設計可擴增出cry1Ac基因完整的開放閱讀框（ORF）的引物對Q5unx和Q3unx，克隆得到cry1Ac全長基因。該基因編碼區(qū)為3 537 bp，編碼1 178個氨基酸，已正式被蘇云金芽孢桿菌δ-內毒素命名委員會命名為cry1Ac28。成功構建了原核表達載體（pEB-cry1Ac），并實現(xiàn)了高效特異性蛋白表達，表達產物的分子質量為133.3176 ku。以上研究結果為進一步研究cry1Ac28蛋白功能和活性打下了良好的基礎。

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