王紹鵬，劉尚武，李 勇，劉偉婷，呂典秋

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086）

微衛(wèi)星序列又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記具有數(shù)量豐富、周期短、不受環(huán)境條件影響，高度多態(tài)性、共顯性及復(fù)等位性,試驗(yàn)重復(fù)性好、結(jié)果可靠性高等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，該技術(shù)克服了形態(tài)學(xué)標(biāo)記、蛋白質(zhì)及同工酶等鑒定技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，成為一種極具實(shí)用價(jià)值的標(biāo)記方法。應(yīng)用SSR標(biāo)記在甜瓜、黃瓜、砂梨等方面已經(jīng)開(kāi)展了研究[3-5]。

多重PCR（Multiplex PCR）技術(shù)是指在一個(gè)單一反應(yīng)體系中加入一對(duì)以上的特異引物對(duì)，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)序列，從而產(chǎn)生高度特異性的反應(yīng)過(guò)程[6]，該技術(shù)能夠適應(yīng)高通量DNA指紋分析的需要，節(jié)省DNA模板和試驗(yàn)耗材，簡(jiǎn)化操作步驟，加速試驗(yàn)進(jìn)程[7]。目前，對(duì)多重PCR體系優(yōu)化的策略和步驟已有大量相關(guān)的研究和報(bào)道[8-11]，但在馬鈴薯作物中，尚無(wú)人開(kāi)展這方面的研究。

本研究對(duì)影響多重PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵因素（模板DNA的純度和濃度、引物的質(zhì)量和特異性、Taq酶的用量及dNTPs的濃度等）進(jìn)行了優(yōu)化分析，建立多重PCR反應(yīng)體系最佳模型，以期在馬鈴薯品種純度鑒定應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，并為馬鈴薯品種遺傳多樣性分析，建立馬鈴薯品種DNA指紋圖譜奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用的馬鈴薯品種保存于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所品種資源庫(kù)，品種信息見(jiàn)表1，多重PCR擴(kuò)增所用引物由加拿大蒙特利爾麥吉大學(xué)科研組提供，并由上海生工生物技術(shù)公司合成（引物序列信息見(jiàn)表2），其他試劑均購(gòu)自大連寶生物試劑公司。

表1 黑龍江省馬鈴薯主栽品種Table 1 Main potato varieties in Heilongjiang Province

表2 試驗(yàn)用引物序列Table 2 Primer sequence in experiment

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯基因組DNA的提取

采用DNA提取緩沖液（Isolation buffer）提取馬鈴薯DNA。

Isolation buffer提取液配方如下：100 mmol·L-1Tris（pH 8.0）、 50 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）、 1.3 mol·L-1NaCl、0.2%SDS、0.5%Triton X-100、1%PVP、10 mmol·L-1DTT、60 mmol·L-1β-mercaptoethanol，其他操作步驟同一般SDS提取方法。將提取的DNA樣品用ddH2O稀釋到60 ng·μL-1后，置于-20℃保存。

DNA質(zhì)量測(cè)定：將提取到的DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳， 0.5 μg·mL-1溴化乙錠（Ethidium bromid，EB）染色，Alpha Innotech公司的December2006型紫外凝膠成像儀檢測(cè)結(jié)果，并用Thermo公司的NANODROP1000型紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA純度和濃度。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系

基礎(chǔ) PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：10×PCR 緩沖液2 μL， 10 mmol·L-1dNTP 0.6 μL， 25 mmol·L-1MgCl21.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.1 μL，4 mmol·L-1上游引物 1 μL，4 mmol·L-1下游引物1 μL（共4對(duì)），滅菌雙蒸水 6.8 μL，DNA 模板 60 ng。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，48.5℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，產(chǎn)物4℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物5 μL，與1 μL 6-Loading Buffer混勻，用12%的聚丙烯酰胺凝膠，在160 V電壓下進(jìn)行電泳，當(dāng)指示劑二甲苯腈遷移至距電泳槽底部1 cm時(shí)停止電泳，用EB染色，利用凝膠成像儀判讀檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.2.3.1 體系成分單因素濃度梯度分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示。

表3 單因素濃度梯度設(shè)置Table 3 Settings of monofactorial concentration gradient

選用馬鈴薯品種克新18作為試驗(yàn)品種，在不改變其他成分濃度條件下，分別對(duì)PCR反應(yīng)體系的各組分進(jìn)行濃度或用量梯度試驗(yàn)，比較不同處理對(duì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果的影響。

1.2.3.2 引物組合正交設(shè)計(jì)

為篩選多重PCR反應(yīng)中引物配比的最佳水平，采用正交設(shè)計(jì)L9（34）在4因素3水平上進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表4。

表4 多重PCR引物因素水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 4 Monofactorial L9(34)orthogonal design of multiplex PCR primers (mmol·L-1）

1.2.3.3 PCR退火溫度選擇

在試驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，利用Biometra公司TGRADIENT型擴(kuò)增儀對(duì)本次試驗(yàn)所用引物的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化篩選，設(shè)置退火溫度為43.0～65.0℃，擴(kuò)增儀自動(dòng)生成12個(gè)梯度擴(kuò)增。

1.2.4 體系優(yōu)化前后擴(kuò)增結(jié)果比較

以克新18為試驗(yàn)材料，比較基礎(chǔ)反應(yīng)體系與優(yōu)化后反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果的差異，每個(gè)體系3次重復(fù)。

1.2.5 優(yōu)化體系穩(wěn)定性測(cè)試

使用優(yōu)化體系對(duì)三個(gè)馬鈴薯品種（克新18、荷蘭15、大西洋）進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，每個(gè)品種兩次重復(fù)，考察優(yōu)化體系的穩(wěn)定性和一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

將提取的馬鈴薯DNA，各取5 μL，與1 μL 6-Loading Buffer混勻，用1%瓊脂糖凝膠，在100 V電壓下，電泳30 min，結(jié)果用紫外凝膠成像儀檢測(cè)。從電泳結(jié)果可以看出：用Isolation Buffer提取液提取的馬鈴薯DNA質(zhì)量好，主帶唯一，無(wú)拖尾和彌散現(xiàn)象（見(jiàn)圖1），3個(gè)樣品的OD260/OD280值均接近于1.8，能夠滿足SSR標(biāo)記的要求（見(jiàn)表5）。

2.2 多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1 Mg2+濃度對(duì)多重PCR體系擴(kuò)增的影響

結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，Mg2+濃度較低時(shí)（1、2泳道），PCR擴(kuò)增不完全，小分子質(zhì)量的多態(tài)性條帶沒(méi)有出現(xiàn)；隨著Mg2+用量的增加（3、4泳道），多態(tài)性條帶數(shù)量也隨之增多，擴(kuò)增更加完全，條帶基本覆蓋整個(gè)泳道；當(dāng)Mg2+用量過(guò)大時(shí)（第5泳道），300～400 bp之間的條帶擴(kuò)增變強(qiáng)，但是240 bp處條帶減弱甚至消失，因此多重PCR反應(yīng)體系中，Mg2+的最佳用量為2.5 μL。

表5 馬鈴薯DNA質(zhì)量分析Table 5 Potato DNA quality analysis

圖1 馬鈴薯DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoretogram of potato DNA

圖2 Mg2+濃度對(duì)PCR體系擴(kuò)增的影響Fig.2 Effect of Mg2+concerntration on PCR amplification system

2.2.2 dNTPs濃度對(duì)多重PCR體系擴(kuò)增的影響

結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著dNTPs濃度的增大，SSR標(biāo)記擴(kuò)增更加完全，條帶數(shù)量增多，如圖3中的2、3、4泳道，條帶數(shù)量均多于第1泳道；當(dāng)dNTPs用量為1.2 μL時(shí)（第5泳道），擴(kuò)增出的特異性條帶數(shù)量急劇減少，不到5條。所以，從擴(kuò)增效果和節(jié)約試劑角度考慮，在多重PCR反應(yīng)體系中，dNTPs的最佳用量為0.6 μL。

圖3 dNTPs濃度對(duì)PCR體系擴(kuò)增的影響

2.2.3 模板濃度對(duì)多重PCR體系擴(kuò)增的影響

在本試驗(yàn)中，模板濃度設(shè)置過(guò)低或者過(guò)高時(shí)均不能得到好的擴(kuò)增效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。其中，1、2泳道小分子質(zhì)量的多態(tài)性條帶基本沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)；第5泳道，條帶數(shù)量相對(duì)3、4泳道少且不清晰；第4泳道擴(kuò)增情況最好，多態(tài)性條帶明亮并且數(shù)量豐富，當(dāng)為模板首選濃度。

圖4 模板濃度對(duì)PCR體系擴(kuò)增的影響Fig.4 Effect of template concerntration on PCR amplification system

2.2.4 Taq酶對(duì)多重PCR體系擴(kuò)增的影響

試驗(yàn)設(shè)定Taq酶用量為5個(gè)梯度，在試驗(yàn)梯度范圍內(nèi)，總的說(shuō)來(lái)，對(duì)多態(tài)性條帶的數(shù)量影響不是很大，差異不明顯，但條帶清晰度差異明顯，在0.8和1.0 U時(shí)，條帶清晰度最好，在1.2 U時(shí)，條帶清晰度有減弱的趨勢(shì)，基于以上分析及從節(jié)約成本的角度看，Taq酶的最佳用量為0.8 U（見(jiàn)圖 5）。

圖5 Taq酶對(duì)PCR體系擴(kuò)增的影響Fig.5 Effect of Taq enzyme on PCR amplification system

2.2.5 引物正交設(shè)計(jì)對(duì)多重PCR體系擴(kuò)增的影響

多重PCR體系在正交設(shè)計(jì)9種組合的情況下擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖6。只有第7、8種組合，體系擴(kuò)增情況不好，泳道多態(tài)性條帶數(shù)量非常少；其余幾種引物組合擴(kuò)增情況基本相同，條帶數(shù)量多，基本覆蓋了整條泳道，并且明亮、清晰，其中第4泳道的擴(kuò)增狀況最好，可以做為優(yōu)化引物組合的首選。

2.2.6 退火溫度對(duì)多重PCR體系擴(kuò)增的影響

退火溫度設(shè)置范圍為43.0～65.0℃，擴(kuò)增儀自動(dòng)生成12個(gè)溫度（見(jiàn)表6）。

圖6 引物正交設(shè)計(jì)對(duì)PCR體系擴(kuò)增的影響Fig.6 Impact of primer orthogonal design on PCR amplification system

PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖7。在1～3的溫度下，PCR擴(kuò)增非常不好，只有200～500 bp的少數(shù)的幾條主亮帶擴(kuò)增出來(lái)；在4～6的區(qū)間，條帶數(shù)量稍有增加，但300～400 bp分子質(zhì)量的條帶沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)或者不清晰，100～200 bp之間只有亮帶擴(kuò)增；7～12區(qū)間，多態(tài)性條帶擴(kuò)增數(shù)量多，但9～12泳道在164 bp處擴(kuò)增條帶較弱或沒(méi)有擴(kuò)增；7、8泳道擴(kuò)增最為完全，從節(jié)約成本的角度選擇，54.7℃為最適退火溫度。

表6 退火溫度梯度Table 6 Gradient of annealing temperature

圖7 退火溫度梯度對(duì)PCR體系擴(kuò)增的影響Fig.7 Effect of annealing temperature gradients on PCR amplification system

2.3 體系優(yōu)化前后擴(kuò)增結(jié)果比較

結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 體系優(yōu)化前后擴(kuò)增結(jié)果比較Fig.8 Comparison of amplification results before and after system optimization

以克新18為試驗(yàn)材料，進(jìn)行體系優(yōu)化前后擴(kuò)增結(jié)果比較?？梢?jiàn)，體系優(yōu)化前擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)量少，大概為優(yōu)化后體系擴(kuò)增條帶數(shù)量的一半，在 200、300～400、1 000～1 500 bp 之間的條帶基本沒(méi)有擴(kuò)增（1～3泳道），優(yōu)化后的體系擴(kuò)增完全，條帶覆蓋整個(gè)泳道，增幅效果明顯（4～6泳道）。

2.4 試驗(yàn)穩(wěn)定性測(cè)試

結(jié)果見(jiàn)圖9。

以黑龍江省馬鈴薯主栽品種大西洋、荷蘭15、克新18為試驗(yàn)材料，進(jìn)行多重PCR優(yōu)化體系穩(wěn)定性測(cè)試。從圖9的電泳結(jié)果可以看出，同一馬鈴薯品種的2次重復(fù)擴(kuò)增結(jié)果一致，組內(nèi)的2個(gè)平行對(duì)照結(jié)果一致。表明所建立的SSR標(biāo)記多重PCR體系擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，從圖9中還可以看到，不同馬鈴薯品種之間的多態(tài)性條帶數(shù)量、帶型有較大差異，品種能夠明顯區(qū)分。

圖9 試驗(yàn)穩(wěn)定性測(cè)試Fig.9 Stability test

3 討論

近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，誕生了一系列DNA分子標(biāo)記技術(shù)，SSR標(biāo)記在動(dòng)植物研究方面[12-13]，已成為遺傳連鎖分析、基因定位以及指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域一個(gè)極為重要的研究手段，同時(shí)也應(yīng)用到品種鑒定的研究中，給作物遺傳育種帶來(lái)巨大變化。

多重PCR與單一PCR相比，一次反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)記，時(shí)間短，所需試劑少，因而高效、快捷又經(jīng)濟(jì)；同時(shí)在靈敏度上高度特異敏感，保證了擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性；極大地減少了工作量，在一定程度上加速了試驗(yàn)進(jìn)程[14]。因此，針對(duì)特定目標(biāo)，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速和有效的多重PCR體系對(duì)促進(jìn)馬鈴薯品種純度鑒定及建立馬鈴薯主栽品種指紋圖譜具有重要意義。

多重PCR要求不同引物能在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對(duì)于試驗(yàn)的條件要求相對(duì)比較嚴(yán)格，針對(duì)不同作物建立相適應(yīng)的多重PCR反應(yīng)體系，是取得試驗(yàn)成功的關(guān)鍵[10]，為了保證多個(gè)目的片段在1個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)特異性擴(kuò)增，體系優(yōu)化成了構(gòu)建多重組合一個(gè)必需的環(huán)節(jié)，因此體系中模板DNA的純度和濃度、引物的質(zhì)量和特異性、Taq聚合酶的用量及dNTP的濃度是對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有明顯影響的幾個(gè)重要因素[9]。在影響多重PCR反應(yīng)的眾多因素中，引物的兼容性和引物濃度的比例是其中兩個(gè)核心因素[10]，引物的兼容性主要原則就是避免引物內(nèi)部形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，引物及引物之間在擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生二聚體，平衡每對(duì)引物的濃度使每個(gè)座位都能獲得足夠的擴(kuò)增量，是優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件的關(guān)鍵。該過(guò)程需要反復(fù)地試驗(yàn),根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果，選擇最合適的各引物的相對(duì)比例。同時(shí)多重PCR反應(yīng)盡量在同一臺(tái)PCR儀或同型號(hào)的不同PCR儀上擴(kuò)增，以保證試驗(yàn)的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)所用4對(duì)引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶分布在不同的范圍，避免了相互之間的拮抗作用，保證了試驗(yàn)的順利進(jìn)行。對(duì)多重PCR體系之中的相關(guān)影響因素逐一進(jìn)行了分析，確立了馬鈴薯SSR標(biāo)記多重PCR體系的優(yōu)化模型，即總體積為 20 μL：25 mmol·L-1MgCl22.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.6 μL，Taq 酶 0.8 U，模板 DNA 80 ng，4 mmol·L-1的 4 對(duì)引物之間的用量比為2∶1∶2∶3，引物退火溫度為54.7℃。優(yōu)化后的反應(yīng)體系重復(fù)性好，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠明顯區(qū)分不同的馬鈴薯品種。本研究為進(jìn)一步探討馬鈴薯品種資源遺傳多樣性、構(gòu)建DNA指紋圖譜打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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