陳禹興，付連雙，王曉楠，李卓夫

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

全球氣候的變暖為高緯度地區(qū)冬小麥的種植提供了條件，上個世紀90年代國家開展冬麥北移項目以來，東北農(nóng)業(yè)大學開展冬麥的育種工作，東農(nóng)024品系2007年經(jīng)黑龍江品種審定委員會審定命名為東農(nóng)冬麥1號，該品種能在黑龍江省冬季積雪較多的北部和東部種植，在冬季積雪較少的西部種植風險很大，因此要求育種上必須培育出抗寒性更強，適應范圍更廣的冬小麥新品種[1-3]。目前，冬小麥安全越冬受兩個因素限制，一是越冬期的低溫傷害；二是返青期倒春寒的傷害。

從返青開始到起身之前，歷時約1個月，屬苗期階段的最后一個時期，稱返青期，倒春寒是指3月下旬至4月氣溫持續(xù)回升，突遭寒流襲擊，氣溫急劇下降到0℃以下的氣候現(xiàn)象。在黑龍江這種高寒地區(qū)，倒春寒更是頻繁出現(xiàn)。此時黑龍江省的冬小麥正處于返青起身的關鍵時期，抗寒性相對較弱，比較容易受凍。寒流過后氣溫急劇上升，冬麥幼苗在很短時間內(nèi)經(jīng)歷了氣溫“回升-急劇下降-急劇升高”的過程，原本受凍的細胞由于溫度回升過快其受損程度進一步加重[3-4]。本試驗擬通過自然低溫馴化后的不同負積溫冷凍處理，以及在冷凍處理恢復生長后給予不同的低溫脅迫，對不同抗寒性的冬麥品種進行細胞膜透性和膜脂過氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量比較研究，探討恢復生長后冬麥植株體內(nèi)細胞膜透性和丙二醛含量的變化規(guī)律與抗寒性之間的關系，為寒地冬小麥返青期抗寒性的生理基礎研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以抗寒性存在顯著差異的東農(nóng)冬麥1號（返青率為78%，DN1）、024-4（返青率為79%）、03-528（返青率為 54%）及濟麥 22（返青率為 0%，JM22）四個品種為材料。供試材料于2009年9月10日播種。

1.2 方法

1.2.1 試驗處理

采用塑料方盒種植冬小麥品種，方盒規(guī)格為550 mm×400 mm×200 mm。在露天自然條件下進行低溫馴化。盆中土壤為細篩過的黑壤土，土層深度15 cm，土壤水分為最大持水量的70%。每盆土壤施入氮、磷、鉀純量分別為3、3.6和1.5 g。采用的肥料為尿素、二銨和硫酸鉀。每盆種植150株，每品種每處理種植3盆。

根據(jù)不同冬麥區(qū)冬季負積溫適應性，共設置120、240和480℃3個冷凍負積溫處理。當負積溫累積到這3個溫度點時，分別取回4份供試材料，并置于當日相同溫度下平衡72 h。隨后由各平衡溫度開始進行升溫處理。升溫處理分為兩個階段，自平衡溫度以2℃·h-1，升溫至-7℃后，再以1.5℃·h-1升溫至5℃。5℃平衡48 h后，置于12～14℃室溫下使其恢復生長10 d后取樣。

恢復生長后的低溫程序：模擬返青期倒春寒的溫度變化對恢復生長10 d后的供試材料進行低溫脅迫處理。降溫以2℃·h-1的速度進行，詳細溫度處理如下：

1.2.2 膜透性的測定

采用電導法測定[5]。取分蘗節(jié)0.2 g，切薄片，置于20 mL燒杯中。加入10 mL去離子水后，用塑料膜封住瓶口，用針頭在塑料膜上均勻刺20個小孔，將這些小燒杯放入真空器中抽真空15 min。抽真空后將燒杯在室溫下放入振蕩培養(yǎng)箱中振蕩1 h，測定其電導率（S1），然后將燒杯放入沸水浴中15 min，殺死分蘗節(jié)組織，取出冷卻至室溫，并在室溫下在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩10 min，測定其電導率（S2）。相對電導率的計算公式：S1/S2。

1.2.3 丙二醛（MDA）含量的測定

參照趙黎芳等方法[6]。取1.5 mL粗提液A，加入2.5 mL 0.5%硫代巴比妥酸（用5%三氯乙酸溶解定容）的溶液?；旌衔锓兴?0 min，冷卻后再離心一次分別測定上清液在450、532和600 nm處的吸光度值，并按公式算出MDA濃度，再算出單位鮮重組織中的MDA含量（μmol·g-1）。

計 算 公 式 ：C（μmol·L-1）=6.45（A532-A600）-0.56A450

式中，A532、A600、A450分別代表450、532和600 nm波長下的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 相對電導率的變化

逆境會導致細胞損傷，膜透性增大，因此可以測定相對電導率來反映逆境對植物組織傷害的程度[7]。越冬期間東農(nóng)冬麥1號、03-528品系和024-4品系3個品種（系）的相對電導率隨著溫度的降低而逐漸升高。濟麥22相對電導率隨著溫度的下降表現(xiàn)為先下降后大幅升高的趨勢。東農(nóng)冬麥1號、03-528和024-4品系3個品種（系）在負積溫120℃和240℃下卻沒有明顯差異，負積溫240℃到480℃處理下，濟麥22上升幅度顯著高于其他3個品種（系），這說明與其他3個品種（系）相比，濟麥22的相對電導率在低溫脅迫時受溫度影響較大。在480℃負積極溫處理中濟麥22的相對電導率達到0.6，與其他品種相比差異極顯著，受低溫傷害嚴重。在負積溫為480℃時，濟麥的相對電導率高于0.5，表明此時濟麥22已經(jīng)死亡[7]。結果見圖1）。比較各品種在恢復生長后經(jīng)受低溫脅迫時，不同品種的相對電導率變化趨勢，結果見圖2。

在不同冷凍負積溫處理中，相對電導率均隨著處理溫度的降低而升高。120℃負積溫處理中，其中濟麥22在-6℃和-9℃低溫脅迫時相對電導率顯著上升，達到0.69和0.71，較-3℃脅迫下相對電導率增幅為70%；東農(nóng)冬麥1號、03-528和024-4品系3個品種（系）雖有上升但是上升幅度較緩。240℃的負積溫處理中，東農(nóng)冬麥1號、03-528和024-4品系恢復生長后，在-3℃和-6℃兩個處理溫度下品種（系）相對電導率差異不顯著，而經(jīng)受-9℃低溫脅迫時顯著上升，其中以024-4上升幅度最大。480℃負積溫處理中，恢復生長后植株相對電導率隨著低溫脅迫的加劇而上升，03-528品系顯著高于東農(nóng)冬麥1號和024-4品系。這說明隨著冷凍負積溫的積累，各品種恢復生長后對低溫脅迫的敏感度增加。03-528品系對低溫的敏感度比東農(nóng)冬麥1號和024-4品系兩個品種（系）高。

比較在不同負積溫冷凍處理后恢復生長的植株在經(jīng)受相同低溫脅迫處理時相對電導率的變化，結果見圖3～6。未經(jīng)受低溫脅迫時，不同負積溫冷凍處理后恢復生長的植株相對電導率差異不明顯；-3℃低溫處理下，負積溫240℃冷凍處理恢復生長后，各品種的相對電導率略低于另兩個處理。在-6℃低溫脅迫下，負積溫120℃相對電導率高于另兩個處理，處理內(nèi)，濟麥22相對電導率顯著高于其他品種（系）。在-9℃低溫脅迫下，負積溫120℃冷凍處理恢復生長后，濟麥22高于其他品種，負積溫240℃時，冬麥1號、024-4、03-528的相對電導率差異不顯著，負積溫480℃時，只有03-528的電導率有所升高，冬麥1號和024-4升高不顯著。由此可以看出，適當?shù)呢摲e溫積累可以在一定范圍內(nèi)提高細胞膜對滲透脅迫的抗性。

2.2 丙二醛（MDA）含量的變化

MDA是細胞膜脂過氧化反應的重要產(chǎn)物，通常以MDA含量作為膜脂過氧化反應的主要指標，MDA含量的多少體現(xiàn)了細胞膜被破壞的程度[8]。由圖7可以看出，負積溫為120℃時濟麥22品種的MDA含量顯著高于東農(nóng)冬麥1號、03-528品系和024-4品系3個品種（系）。

圖7 負積溫處理下不同抗寒性冬小麥分蘗節(jié)中丙二醛含量變化Fig.7 Change of MDA content in tillering nodes of different cold resistance winter wheat in negative accumulated temperature treatment

隨著負積溫的增加，東農(nóng)冬麥1號、03-528品系的MDA含量升高，而濟麥22、024-4品系的含量卻下降。負積溫240℃時，濟麥22的MDA含量仍然高于其他品種（系），024-4品系的MDA含量顯著低于其他品種。負積溫480℃下，東農(nóng)冬麥1號、濟麥22、03-528品系的MDA含量較負積溫240℃時略有下降，024-4品系的MDA含量上升，4個品種（系）之間差異不顯著。

比較分析各品種在冷凍處理恢復生長后經(jīng)受低溫脅迫時，不同品種的MDA含量變化趨勢，結果見圖8。負積溫120℃冷凍處理的植株恢復生長，濟麥22丙二醛含量高于東農(nóng)冬麥1號、03-528品系和024-4品系，在未經(jīng)受低溫脅迫和經(jīng)受-9℃脅迫時這種差異最顯著。各品種未經(jīng)受低溫脅迫時MDA含量最低，-3℃和-6℃脅迫下的各品種MDA含量差異不顯著，濟麥22和03-528品系在-6℃脅迫下的MDA含量相比-3℃脅迫分別下降 0.4 和 0.56 μmol·g-1。-9 ℃脅迫下各品種MDA含量顯著上升，其中濟麥22上升到7.12 μmol·g-1增幅最大，為73.34%。負積溫240℃冷凍處理的植株恢復生長后，03-528品系的MDA含量在不同溫度低溫脅迫中均高于東農(nóng)冬麥1號、024-4品系。-6℃脅迫處理下各品種的MDA含量較-3℃和-9℃脅迫處理的含量有所降低。負積溫480℃冷凍處理的植株恢復生長后，東農(nóng)冬麥1號、03-528和024-4品系3個品種（系）之間的MDA含量差異比前兩個處理品種間差異小，且在-6℃低溫脅迫下各品種的MDA含量最低。通過以上分析可以得出，抗寒性弱的品種在低溫下MDA含量較高，而不同返青處理的植株-6℃低溫脅迫下的MDA含量較其他低溫處理時低。

進一步分析不同冷凍處理恢復生長的冬麥植株在經(jīng)受相同低溫脅迫處理時MDA含量的變化，結果見圖 9～12。

由圖9可知，在未接受低溫處理時，負積溫120℃冷凍處理的植株恢復生長后，濟麥22的MDA含量最高，隨著冷凍處理溫度的降低，東農(nóng)冬麥1號、03-528和024-4品系的MDA含量普遍增加，東農(nóng)冬麥1號和03-528在冷凍負積溫480比240℃處理低。由圖10可知，-3℃低溫脅迫時，負積溫240℃冷凍處理恢復生長的東農(nóng)冬麥1號、03-528和024-4品系3個品種（系）的MDA含量高于另外兩個返青溫度處理，其中03-528品系差異最顯著；負積溫480℃冷凍處理恢復生長后，各品種（系）MDA含量為冷凍處理中最低。由圖11可知，在-6℃低溫脅迫下，隨著返青起始溫度的下降各品種（系）MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢；各起始溫度處理內(nèi)部MDA含量差異較小。由圖12可知，在-9℃低溫脅迫下，負積溫120℃冷凍處理恢復生長后，濟麥22品種MDA含量最高。不同的低溫脅迫下，濟麥22和03-528品系的MDA含量普遍高于東農(nóng)冬麥1號和024-4品系。

3 討 論

3.1 相對電導率的的變化

質(zhì)膜是細胞與環(huán)境之間的界面，各種逆境對細胞的影響首先作用于質(zhì)膜，而逆境脅迫對質(zhì)膜結構和功能的影響通常表現(xiàn)為選擇性的喪失，電解質(zhì)和某些小分子有機物質(zhì)大量滲漏，從而引起相對電導率的上升[9]。

本試驗中，抗寒性較高的東農(nóng)冬麥1號、03-528和024-4品系在越冬期間相對電導率隨著負積溫的積累有所上升，但上升幅度顯著低于抗寒性弱的濟麥22。當負積溫累積到480℃時，濟麥22相對電導率大幅度上升，達到0.6，說明此時濟麥22植株受凍害嚴重，甚至于死亡。不同負積溫處理的植株返青后，在低溫脅迫下隨著脅迫溫度的降低，相對電導率均有不同幅度升高，抗寒性弱的品種升高幅度較大。在-9℃低溫脅迫時東農(nóng)冬麥1號、03-528和024-4品系的相對電導率均接近0.5，這說明在-6℃至-9℃低溫脅迫之間可能具有植株耐受低溫的臨界值。值得注意的是，-3℃和-6℃低溫脅迫下，240℃負積溫返青處理中各品種的電導率值比其他兩個負積溫處理的電導率值低，這說明一定程度上的負積溫的積累可以提高植株的抗寒性。但隨著負積溫的逐步累積，低溫對植株造成傷害有所加深。

3.2 MDA含量的變化

MDA作為膜脂過氧化終產(chǎn)物，對植物細胞膜系統(tǒng)結構和功能都具有較顯著影響。MDA不僅能與蛋白結合從而引起生物膜中結構蛋白和酶的聚合并使它們的結構功能和催化功能發(fā)生改變，還可以降低膜中不飽和脂肪酸的含量，從而降低膜流動性[10]。很多研究都證實，當MDA含量積累到一定程度時，相對電導率會顯著上升[11-12]。Simon指出膜脂過氧化引起膜透性增加的直接原因可能是磷脂性質(zhì)的改變，間接原因可能是膜蛋白在過氧化過程中受到傷害。

本試驗中，當負積溫積累到240℃時，東農(nóng)冬麥1號和03-528品系的MDA含量升高，而濟麥22和024-4品系的含量卻下降。此時，濟麥22的MDA含量仍然高于其他品種，而024-4品系的MDA含量顯著低于其他品種。濟麥22品種的MDA含量的變化可能是由于11月初氣溫突然下降，從而導致越冬初期抗寒性較弱的濟麥22膜系統(tǒng)受損并隨著溫度的逐漸穩(wěn)定而有所恢復。說明濟麥22在遭遇突然降溫的情況下，膜脂過氧化反應比其他品種劇烈。024-4品系的MDA含量變化的原因不明，還有待進一步研究。在不同負積溫返青處理之間，480℃負積溫處理中各品種（系）在不同低溫脅迫下均表現(xiàn)出較低的丙二醛含量水平。可以推測，越冬期負積溫的累積對膜脂抗氧化具有積極意義。還有一點值得關注的是，無論120℃、240℃，還是480℃負積溫的返青處理，給予-3℃、-6℃和-9℃三個低溫處理后，丙二醛含量均表現(xiàn)為-6℃處理下最低，顯著低于-3℃和-9℃低溫處理下的丙二醛含量，這點與不同負積溫起始低溫處理下電導率的變化結果一致，由此可以得出，冬小麥分蘗節(jié)對返青期低溫也有一個適應過程，經(jīng)過-3℃低溫脅迫下，抗寒性有所增強，在-6℃低溫脅迫時，細胞膜也有所恢復，但是進一步的低溫，又會導致膜脂過氧化的加劇。

4 結 論

伴隨著植物恢復生長后低溫脅迫的加劇，MDA含量呈上升趨勢，細胞膜透性增大，相對電導率相應增加。因此，丙二醛和相對電導率可在一定程度上反映冬小麥品種抗寒性的強弱。不同抗寒性冬麥品種（系）植株恢復生長后，在低溫脅迫下仍表現(xiàn)出顯著差異，抗寒性強的品種（品系）質(zhì)膜的穩(wěn)定性大于抗寒性弱的品種（系）?；謴蜕L的冬小麥對低溫也有適應的過程，-3℃低溫脅迫下，抗寒性加強，-6℃細胞膜有所恢復，進一步的低溫，則膜脂過氧化加劇。

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