范蓮芝,孫喜明,王桂英,孟德雁

糖尿病以慢性高血糖為主要共同特征。高血糖致血管內(nèi)皮細胞受損是形成動脈粥樣硬化的重要原因之一。肝細胞生長因子(HGF)是由間質(zhì)來源細胞分泌的多效性生長因子,具有促進多種類型的細胞增殖、遷移和新生血管形成的作用[1]。本文研究了不同作用時間高糖對人血管內(nèi)皮細胞(EC304)增殖及HGFmRNA表達的影響,探討糖尿病患者高血糖致血管內(nèi)皮細胞受損的原因。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器 RPMI1640(Gibco),胎牛血清(杭州四季青),Trizol(上海生工),RT-PCR試劑盒(大連寶生物),PCR儀(PTC100型),電泳儀(型號PS3000),紫外凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVP型號GDS7500),其余為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) 人血管內(nèi)皮細胞(EC304,南京凱基生物工程有限公司提供)。EC304細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中,置37℃含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育,待長致瓶底的60%～80%,用0.05%的胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 M TT法分析高糖對血管內(nèi)皮細胞增殖的作用 將對數(shù)生長期細胞以5×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24 h后,改用無血清培養(yǎng)液孵育24 h,使細胞處于相對靜止期后按下列方法分為4組。對照組,培養(yǎng)液含D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L。15 mmol/L組,培養(yǎng)液 D-葡萄糖濃度為15 mmol/L。25mmol/L組:培養(yǎng)液D-葡萄糖濃度為25mmol/L。35mmol/L組,培養(yǎng)液D-葡萄糖濃度為35mmol/L。每組設(shè)6個復(fù)孔,同時設(shè)調(diào)零孔。分別于培養(yǎng)后6 h、12 h、24 h、48 h、96 h進行M TT檢測。為排除培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分消耗對結(jié)果產(chǎn)生的影響,每隔48 h換 1次培養(yǎng)上清。反應(yīng)結(jié)束后每孔加入 25 μL M TT(5 mg/mL)溶液,繼續(xù)孵育4 h,棄上清,每孔加入100 μ L二甲基亞砜(DMSO),在微型混合器上振蕩30 min后于酶標儀490 nm處測光吸收(OD)值。

1.4 RT-PCR方法檢測HGFmRNA的表達

1.4.1 總RNA的提取 將對數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細胞以2×105/mL的密度轉(zhuǎn)種于50 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中,同步化后分為兩組,對照組培養(yǎng)液含D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L。高糖組培養(yǎng)液含D-葡萄糖濃度為25 mmol/L。每組同時重復(fù)3次。于培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、96 h 后用 Trizol試劑提取細胞總RNA,提取的細胞總RNA用紫外分光光度計測定RNA的純度;OD260與OD280比值為1.8～2.0,說明 RNA純度符合實驗要求。

1.4.2 RT-PCR HGF根據(jù)Genebank的大鼠HGF基因cDNA序列由Primer3軟件設(shè)計:上游引物:5'-ACA GCT TTT TGC CTT CGAGCT A-3';下游引物:5'-CAT CAA AGC CCT TGT CGG GAT A-3'。預(yù)期擴增產(chǎn)物長度290bp。內(nèi)參照為GAPDH,引物設(shè)計參照文獻[2]:正義序列:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',反義序列:5'-TCCACCA CCCTGTTGCTGTA-3';PCR反應(yīng)參數(shù)為:預(yù)變性94℃5 min,變性94℃30 s,退火 58 ℃30 s,延伸72 ℃45 s,共 30個循環(huán),再延伸72℃5 min;預(yù)期擴增產(chǎn)物大小為450bp。

1.4.3 PCR產(chǎn)物的檢測 用0.5×TEB制備1.8%瓊脂糖凝膠,在0.5×TEB中恒壓電泳,完畢后經(jīng)紫外凝膠圖像分析儀進行數(shù)據(jù)分析,以目的基因mRNA擴增后產(chǎn)物的紫外OD值與內(nèi)參照GAPDHmRNA擴增后產(chǎn)物紫外OD值的比值作為HGFmRNA的相對值。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同作用時間的細胞增殖 對照組(5.5 mmol/L組)細胞從6 h～96 h持續(xù)增殖。EC304在高糖的誘導(dǎo)作用下,6 h時各組細胞增殖能力無明顯差別,但隨著作用時間的延長,作用12 h時,細胞增殖較對照組明顯增強,且隨著濃度的增加,細胞增殖明顯增強,細胞增殖致24 h達高峰,48 h細胞增殖被抑制,細胞數(shù)量較24 h明顯減少,出現(xiàn)抑制細胞增殖的現(xiàn)象,96 h細胞的數(shù)量進一步減少,且呈濃度依賴性。詳見表1。

表1 高糖對EC304細胞增殖的影響(±s)

表1 高糖對EC304細胞增殖的影響(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h 5.5 mmol/L組 0.221±0.012 0.290±0.008 0.401±0.011 0.625±0.005 0.990±0.025 15 mmol/L組 0.227±0.010 0.357±0.0081) 0.474±0.0051) 0.428±0.0071) 0.376±0.0111)25 mmol/L組 0.223±0.010 0.419±0.0071) 0.536±0.0061) 0.435±0.0061) 0.309±0.0101)35 mmol/L組 0.222±0.009 0.470±0.0101) 0.664±0.0121) 0.448±0.0071) 0.222±0.0111)與對照組(5.5 mmol/L)相比,1)P＜0.05

2.2 各組細胞HGFmRNA的表達 作用6 h,高糖組HGFm RNA的表達與對照組無明顯差別,作用12 h,高糖組HGFmRNA的表達較對照組升高,作用24 h,HGFmRNA的表達開始降低,隨著作用時間的延長,HGFmRNA的表達逐漸降低,即高糖降低HGF mRNA的表達。詳見表2。

表2 高糖對EC304 HGFmRNA表達的影響(±s)

表2 高糖對EC304 HGFmRNA表達的影響(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h對照組 0.839±0.047 0.840±0.033 0.827±0.052 0.867±0.033 0.859±0.032高糖組 0.816±0.069 1.451±0.1261) 0.756±0.620 0.611±0.0191) 0.422±0.0121)與對照組相比,1)P＜0.05

3 討 論

糖尿病以慢性高血糖為共同特征。血管內(nèi)皮細胞分泌多種血管活性物質(zhì),血管內(nèi)皮細胞功能紊亂促進動脈粥樣硬化;高血糖造成內(nèi)皮細胞功能失常,使多種內(nèi)皮細胞源性因子如HGF、前列腺環(huán)素(PGI2)、一氧化氮(NO)、C型利鈉素(CNP)等合成減少,導(dǎo)致血管的硬化改變[3],因而保護血管內(nèi)皮細胞可抑制動脈粥樣硬化,減少糖尿病人群心腦血管病患病率。

血管內(nèi)皮損傷是血管病變的基礎(chǔ),糖尿病有多種因素可直接或間接導(dǎo)致血管壁受損,使內(nèi)皮細胞功能紊亂,內(nèi)皮損傷可能是動脈粥樣硬化起始過程,隨后出現(xiàn)血小板生長因子釋放,后者引起血管平滑肌增生[4]。本實驗觀察到高糖早期通過上調(diào)HGFmRNA的表達誘導(dǎo)細胞增殖,晚期HGFmRNA表達下調(diào),誘導(dǎo)細胞凋亡。高糖刺激血管內(nèi)皮細胞早期增殖可能的機制之一是:血管內(nèi)皮細胞作為對高糖損傷應(yīng)激性地引起HGF分泌增加,即高糖環(huán)境下12 h,HGFmRNA表達上調(diào),細胞增殖明顯增加,隨著作用時間的延長,高糖誘導(dǎo)細胞凋亡,HGFmRNA表達下調(diào)。高糖環(huán)境下bax-caspase蛋白激酶被激活而誘導(dǎo)細胞凋亡,且濃度增加細胞死亡明顯增加,高葡萄糖主要增加bax蛋白,而不影響bcl-2,并且激活 caspase3和caspase9;而 HGF主要增加bcl-2的表達,影響 bax水平,并且減少 caspase3和caspase9的活性;高D-葡萄糖引起bax蛋白的遷移也能夠被過度表達bcl-2完全阻斷[5]。另外高濃度D-葡萄糖通過促進轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)分泌抑制局部 HGF產(chǎn)生,而 HGF具有明顯的促細胞有絲分裂增殖作用,給予TGF-β抗體可以抑制這種減少[6]。因而HGF系統(tǒng)在糖尿病動脈粥樣硬化中具有重要作用。

臨床可應(yīng)用HGF抑制或延緩動脈粥樣及促進新生血管形成。Morishita等[7]對患有嚴重肢體缺血性疾病患者給予HGF質(zhì)粒DNA治療,認為肌注HGF質(zhì)粒DNA治療是安全有效,并且能夠獲得成功治療。

HGF系統(tǒng)在糖尿病動脈粥樣硬化中具有重要作用,HGF可促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和新生血管形成,抑制其凋亡,在內(nèi)皮細胞的凋亡與增殖平衡中發(fā)揮重要作用,維持血管內(nèi)皮細胞功能;抑制動脈粥樣硬化,減少糖尿病患者心腦血管的并發(fā)癥。

[1] Mo rishita R,Aoki M,Hashiya N,et al.Therapeutic angiogenesis using hepatocyte g rowth factor(HGF)[J].J Curr Gene Ther,2004,4(2):199-206.

[2] Yoshida S,Harada T,Mitsunari M,et al.Hepatocyte g rowth factor/met system promotes endometrial and endometriotic stromal cell invasion via autocrine and paracrine pathways[J].Clin Endocrinol Metab,2004,89(2):823-832.

[3] Nishimura M,Ushiyama M,Ohtsuka K,et al.Serum hepatocyte g rowth factor as a possible indicator of vascular lesions[J].J Clin Endocrinol Metab,1999,84(7):2475-2480.

[4] T schoepe D,Roesen P,Schwippert B,et al.Platelets in diabetes:T he role in the hemostatic regulation in atherosclerosis[J].Semin T hromb Hemost,1993,19(2):122-128.

[5] Nakagami H,Morishita R,Yamamoto K,et al.Hepatocyte g rowth factor prevents endothelial cell death through inhibition of bax translocation from cytosol to mitochondrial membrane[J].Diabetes,2002,51(8):2604-2611.

[6] Morishita R,Nakamura S,Nakamura Y,et al.Potential role of an endothelium-specific g rowth factor,hepatocyte g rowth factor,on endothelial damage in diabetes mellitus[J].Diabetes,1997,46(1):138-142.

[7] Mo rishita R,Aoki M,Hashiya N,et al.Safety evaluation of clinical gene therapy using hepatocyte growth factor to treat peripheral arterial disease[J].Circulation,2004,44(2):203-209.